乳腺癌是女性最常见和死亡率最高的恶性肿瘤。侵袭转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，也是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，但具体过程和机理至今尚不明确。因此，进一步研究乳腺癌侵袭转移机制并探索有效的防控措施，对提高患者的生存率和生存质量具有重要意义。恶性肿瘤的发生和侵袭转移过程受多层次、多因素调控，癌基因与抑癌基因作用的失衡是其中的关键环节之一。因此，寻找新的或进一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能，对阐明恶性肿瘤发生和演进机理、研发潜在治疗靶点具有重要意义。Wilms瘤基因1(Wilms’ tumor gene1，WT1)首先在肾母细胞瘤(又称Wilms瘤)中作为抑癌基因被克隆鉴定，定位于11p13。WT1编码产物是一种具有转录激活和抑制双重功能的锌指转录因子。在发育过程中，WT1通过调控多种靶基因和信号通路参与心脏、肾脏和脾脏等器官的形成。研究表明WT1在成体组织中的异常表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关，但根据细胞特征不同，其可发挥癌基因或抑癌基因作用。一方面，在Wilms瘤等儿童恶性肿瘤中，WT1通过干扰细胞增殖信号等途径抑制细胞生长，发挥抑癌基因作用；另一方面，WT1可增强肿瘤细胞得抗凋亡能力，并通过调控原癌基因K-ras促进细胞增殖，提示WT1也能发挥癌基因作用。根据目前关于WT1与乳腺癌的临床研究结果，多数学者倾向于认为WT1在乳腺癌中发挥癌基因作用，但该结论并未得到所有研究团队的证实、仍存一定争议。系统回顾WT1在乳腺癌领域的研究成果，我们发现：WT1的表达情况与乳腺癌患者临床病理特征及预后的关系至今尚无明确结论，尤其是其在乳腺癌不同分子亚型中的表达是否存在差异未见文献报道。同时，WT1在乳腺癌进展中的具体作用和机制至今尚不清楚，其促进还是抑制细胞增殖尚存争议，而其是否参与乳腺癌的侵袭转移过程、具体作用及分子机制如何，未见文献报道。此外，虽然已知WT1可调控下游多种生长因子发挥生物学作用，但对其上游调控机制的研究和认识甚少。针对上述问题，本研究通过生物信息学方法挖掘、分析已公布的基因芯片数据，阐明WT1mRNA与乳腺癌分子亚型及患者预后的关系；通过免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)的方法检测乳腺癌组织WT1蛋白表达情况，并分析其与患者临床病理特征的关系。采用RNA干扰(RNAinterfering，RNAi)技术下调WT1表达，采用RNA激活(RNA activating, RNAa)技术上调WT1表达，借此分析WT1在乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期、侵袭及迁移中的作用，并以细胞增殖及转移关键分子—抑制分化抑制因子1(inhibitor of differentiation1)为切入点初步探讨WT1发挥生物学功能的分子机制。同时，通过建立转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)诱导的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)细胞模型，探索TGF-β1对WT1的调控作用及效应；通过对TGF-β1单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与乳腺癌发病风险的关系进行meta分析，进一步揭示其与乳腺癌发生的关系。通过上述研究以期初步探讨WT1在乳腺癌进展中的作用及分子机制，为进一步揭示WT1在恶性肿瘤中生物学行为提供实验依据，为恶性肿瘤的分子靶点的研发提供新的思路。实验方法和主要结果1. WT1与乳腺癌原发肿瘤特征及预后的关系方法：利用生物信息学的方法挖掘包含266例乳腺癌患者的GSE21653基因芯片数据，分析WT1mRNA表达水平与乳腺癌分子亚型及预后的关系；免疫组织化学法检测46例乳腺癌组织WT1蛋白表达情况，分析其与患者临床病理特征的关系。结果：在GSE21653中，WT1mRNA在组织学分级高(G2vs. G1, P=0.0260; G3vs.G1, P=8.04e-5)、ER阴性(ER阴性vs. ER阳性, P=0.0500)、Basal-like型及ERBB2/HER-2过表达型(Basal-like型vs. Luminal A型, P=0.0049; Basal-like型vs. Luminal型,P=0.0350; ERBB2/HER-2过表达型vs. Luminal型, P=0.0350)的乳腺癌患者中表达水平明显升高。单变量分析显示WT1mRNA高表达患者的无病生存率显著低于低表达患者(风险比[HR]=3.294,95%可信区间[CI]=1.198-9.055, P=0.014)，多变量分析显示WT1是乳腺癌患者的独立预后不良因素(HR=3.4539,95%CI=1.2029-9.918, P=0.0213；WT1mRNA高表达患者vs. WT1mRNA低表达患者)。在46例乳腺癌患者中，WT1蛋白阳性表达率为84.8%(39/46)。WT1表达与患者年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结分期、TNM分期、ER、PR、HER-2状态及分子亚型均无明显关系(P＞0.05)。2. WT1在乳腺癌中的生物学作用及下游信号分子机制初步探讨方法：qRT-PCR、Western blotting(WB)和免疫细胞化学法检测WT1在人乳腺癌MCF-7、Bcap-37、SKBR-3及MDA-MB-321细胞中的表达情况，筛选WT1高表达和低表达细胞。以国外学者提供的三条序列为靶点构建WT1小干扰RNA(siRNA)以沉默表达WT1，以文献公布的、已证实可上调表达WT1的序列构建双链RNA(dsRNA)以过表达WT1，通过脂质体法分别转染MDA-MB-321和MCF-7细胞，通过qRT-PCR和WB筛选作用效果最明显的siRNA和dsRNA。利用CCK8、Annexin V/PI及transwell法观测干扰WT1表达后对乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期、侵袭及迁移能力的影响。同时通过qRT-PCR和WB检测干扰WT1后对细胞Id1蛋白表达水平的影响。结果：WT1在MDA-MB-321中的表达水平明显高于其在MCF-7、Bcap-37和SKBR-3中的表达水平，确定以MDA-MB-231作为RNAi细胞模型、以MCF-7作为RNAa细胞模型。成功构建三个WT1siRNA并转染到MDA-MB-231细胞中，均能够有效抑制WT1mRNA和蛋白的表达，以转染48h时WT1siRNA-1029的效果最为显著。使用WT1siRNA-1029转染MDA-MB-231细胞、干扰其WT1表达后，细胞的增殖能力下降，同时早期、晚期凋亡细胞和G1期细胞比例增加，S期和G2期细胞比例降低，细胞的侵袭及迁移能力降低；干扰WT1可下调Id1蛋白的表达水平并使细胞的侵袭迁移能力下降。成功将WT1dsRNA-319转染到MCF-7细胞中，在50μmol/L、转染96h时WT1dsRNA-319对MCF-7细胞WT1的过表达作用最为显著，且这一过程伴随MCF-7细胞增殖、侵袭及迁移能力的增高。3. TGF-β1调控WT1表达的效应观察研究及TGF-β1单核甘酸多态性与乳腺癌发病风险关系的meta分析方法：使用TGF-β1（浓度：10ng/ml，作用时间：48h）诱导MCF-7细胞，观察细胞形态变化、WT1mRNA、蛋白水平改变情况以及细胞侵袭迁移能力变化。利用计算机检索截止2010年3月MEDLINE、PubMed、Web of Science、EMBASE、CNKI、万方、VIP和中国生物医学服务系统(SinoMed)等数据库中有关TGF-β1T869C和C-509T多态性与乳腺癌发病风险关系的研究，根据纳入标准提取有效数据后，采用STATA软件进行meta分析。结果：加入TGF-β1可使乳腺癌MCF-7细胞由上皮细胞样形态转变为间质细胞样形态，这一过程伴随WT1mRNA和蛋白表达水平的显著升高，同时还可使MCF-7细胞的侵袭及迁移能力明显增高。Meta分析结果显示，TGF-β1基因T869C多态性的C等位基因与总体人群乳腺癌发病风险无关(C vs. T: OR=1.033,95%CI=0.996–1.072)，但亚群分析显示其与高加索人乳腺癌发病风险增高有关(C vs. T: OR=1.051,95%CI=1.018–1.085; CC vs. TT+TC: OR=1.083,95%CI=1.019–1.151)；TGF-β1基因C-509T多态性的T等位基因与总体人群乳腺癌发病风险无关(T vs. C: OR=0.986,95%CI=0.936–1.039)。结论1、WT1在乳腺癌中发挥癌基因样功能，可增强乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，导致乳腺癌恶性程度增加。依据有：①WT1在组织学分级高、ER阴性的Basal-like型、HER-2过表达型的乳腺癌中表达水平显著增高，WT1高表达可能是乳腺癌患者的独立预后不良因素；②干扰WT1表达可使MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭及迁移能力降低，而过表达WT1可使MCF-7细胞的增殖、侵袭及迁移能力升高。2、TGF-β1可能是WT1的上游调控分子，而Id1可能是WT1的下游靶分子。依据有：①TGF-β1可上调MCF-7的WT1表达水平，并增强细胞的侵袭迁移能力；②干扰MDA-MB-231细胞的WT1表达，可导致Id1表达水平降低以及细胞侵袭迁移能力的下降。3、TGF-β1基因T869C多态性的C等位基因与高加索人群乳腺癌发病风险升高有关，提示：检测TGF-β1基因T869C多态性有助于从遗传角度评估乳腺癌发病风险。