外源基因在宿主体内的表达水平是决定生物反应器能否产业化的关键。制约植物生物反应器应用的主要问题是,外源蛋白在植物体内的累积水平低,生产成本高,产品没有市场竞争能力。若要实现工业生产,理论上外源蛋白的表达量应达到植物总可溶性蛋白的1%以上。目前,人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)在很多宿主细胞中都得到表达,但用植物生产人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子时,表达水平很低,远未达到工业生产要求。人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是一种能够刺激粒细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化的糖蛋白。它是一种造血生长因子,能提高机体的免疫能力,主要用于治疗在骨髓移植、癌症化疗等过程中引起的白细胞减少病症。hGM-CSF基因全长2.5 kb,含有4个外显子和3个内含子。人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子由144个氨基酸组成,其中前17个氨基酸为信号肽,成熟hGM-CSF由127个氨基酸组成,相对分子量约为16, 293。本研究选用在种子中特异表达的β-伴大豆球蛋白α’亚单位启动子,在启动子下游插入烟草花叶病毒的5′非转录区(Ω序列)。对翻译起始位点序列进行改造,使之符合植物Kozak序列的特征。本研究对hGM-CSF基因进行人工改造,包括:①对hGM-CSF基因的信号肽进行人工改造。用菜豆植物血球凝集素(PHA-E)的信号肽替换hGM-CSF的信号肽,PHA-E信号肽具有偏向植物氨基酸密码子的特点,有助于提高基因的翻译水平。②对hGM-CSF基因的末端进行人工改造。hGM-CSF末端分别连接了内质网驻留信号(KDEL)和贮藏囊泡靶向信号。KDEL四肽能够将目标蛋白导向内质网,避免蛋白受到蛋白酶的破坏,从而提高目标蛋白的积累水平。在hGM-CSF基因的末端加上菜豆7S球蛋白(phaseolin)贮藏囊泡靶向信号(AFVY),AFVY短肽能够将重组蛋白导向蛋白贮藏囊泡,提高种子中蛋白的积累。③对hGM-CSF基因的3’-非翻译区进行人工改造。在hGM-CSF基因的3’-非翻译区插入人的7SL RNAⅣ区的44个核苷酸,7SL RNAⅣ区能够形成具有三个环的二级结构,与信号识别颗粒(SRP)中的蛋白亚基SRP54结合,是一种“天然”的适配体(aptamer)。将改造后的启动子和hGM-CSF基因构建成表达载体pCAMBIA2300-CSF1、pCAMBIA2300-CSF-KDEL、pCAMBIA2300-CSF-AFVY、pCAMBIA2300-CSF-AP,转化拟南芥。本研究还探讨了利用反义干扰技术来提高外源基因的表达可行性。利用拟南芥at2S2基因本身的启动子和poly(A)信号,构建含反义at2S2基因的表达载体pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S和pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2S,转化拟南芥。将构建的pCAMBIA2300-CSF1、pCAMBIA2300-CSF-KDEL、pCAMBIA2300-CSF-AFVY、pCAMBIA2300-CSF-AP、pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S和pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2S表达载体转化拟南芥,在含卡那霉素的培养基上筛选。分别筛选出C(转化pCAMBIA2300-CSF1)、KD(转化pCAMBIA2300-CSF-KDEL)、AF(转化pCAMBIA2300-CSF-AFVY)、AP(转化pCAMBIA2300-CSF-AP)、KDS (转化pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S )、AFS (转化pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2S)转基因株系50、32、28、6、7、9个。AP、KDS和AFS系列转基因植株出现部分植株种子败育的现象,但仍有一部分植株得到后代并且能够稳定遗传下去。采用PCR扩增初步验证转基因植株。Southern杂交表明,AP、KDS、AFS系列的转基因植株,虽然存在拷贝数的差异,但外源基因已经整合到基因组中。对于AF和KD系列的转基因单株,计算T2代分离比例,初步筛选出单拷贝的转化株,再根据Southern杂交的结果,筛选出单拷贝转基因植株。对单拷贝的转化株,用KD6转化株作为花粉供体,分别与其他单拷贝的KD、AF转化株进行杂交。取KD6转化株根、茎、叶和授粉6天的种子,提取RNA,经DNAaseⅠ处理后,用hGM-CSF基因特异引物进行RT-PCR。结果显示,β-伴大豆球蛋白α’亚单位启动子在根、茎、叶中都没有明显的表达,在种子中特异表达。取KD6转化株不同发育时期的种子,半定量RT-PCR表明,β-伴大豆球蛋白α’亚单位启动子在种子发育早期就开始表达,以后逐渐增强,到种子发育后期仍有很强的表达。ELISA分析结果显示,C系列转基因植株未成熟荚中重组hGM-CSF蛋白含量低于0.01%,在hGM-CSF基因3’-末端加上导向信号后重组蛋白含量显著提高。KD与AF系列转基因植株的rhGM-CSF表达水平没有显著的差异。表明AFVY和KDEL信号都能够显著提高重组蛋白在种子中的积累。KD×KD6和AF×KD6杂交当代种子ELISA结果表明,KD×KD6与AF×KD6杂交株当代种子中显示出基因加性效应,但AF×KD6杂交株基因加性效应比KD×KD6明显。取重组蛋白积累水平相近的KD1、AF18母本,分别与KD6杂交后,对杂交当代种子中hGM-CSF mRNA定量分析表明,hGM-CSF mRNA表达水平无显著差异,但重组蛋白的积累水平差异显著,表明AFVY和KDEL信号在重组蛋白筛选和运输途径中独立起作用。AP系列转化株的蛋白积累平均值比KD要高1倍以上,方差分析表明两组平均值之间存在极显著差异。对KD和AP系列的转基因植株进行hGM-CSF mRNA定量结果显示,mRNA水平越高,重组蛋白积累水平就越高,表明hGM-CSF基因3’-非翻译端插入7SL RNAⅣ区核苷酸对mRNA的稳定起作用。对KDS、AFS系列转基因植株at2S2基因mRNA定量分析显示,反义干扰显著抑制at2S2基因的表达。SDS-PAGE蛋白电泳结果显示,拟南芥种子中2S、12S-A和12S-B各个组分之间相对量无明显变化。抑制at2S2基因表达并没有改变种子中主要沉降蛋白组分比。反义干扰的转基因植株重组蛋白表达水平与KD、AF之间有极显著的差异,表明抑制at2S2基因表达能够提高重组hGM-CSF蛋白的积累,但hGM-CSF和atS2基因的mRNA定量分析表明,at2S2基因抑制程度与hGM-CSF基因表达水平之间并不存在线性关系。Western杂交结果显示,KD、AF和AP表达的重组hGM-CSF蛋白分子量大约在21 kDa左右,与转基因烟草相似,比天然hGM-CSF分子量要大5 kDa左右。表明植物中表达的重组hGM-CSF蛋白糖基化水平较高。TF-1细胞增殖实验表明,植物中表达的重组hGM-CSF蛋白具有完全生物活性。