研究背景细胞是生命结构和功能的基本单位,生物打印技术将细胞作为生物墨水打印构建组织和器官,标志着3D打印技术与生命科学的真正融合。与通常3D打印技术强调产品的制造精度和机械强度不同,生物打印技术更多的考虑的是细胞生物学表现。生物打印平台的构建、打印方案的设计和打印后产品的评价都围绕着细胞展开。由于生命科学极端复杂、多变,人类对细胞的理解十分粗浅,有太多的未知等待着探索,即使在科技发展日新月异的今天,生物打印技术仍然处在萌芽阶段,现阶段生物打印技术的研发与应用仍然属于概念验证,距离实现具备生理功能的组织、器官的人工打印再造的目标仍有很长的路要走。生物打印平台的建立是实现生物制造的必要条件,亦是生物打印领域内面临诸多挑战之一。生物打印机绝不是简简单单堆砌细胞和生物材料的装置,打印平台的建立代表了细胞生物学、生物材料学、自动控制、信息学等诸多学科高水平交叉综合应用的实力,体现了对生物打印核心技术的掌握。目前生物打印平台的搭建技术并不成熟,根据打印的细胞、生物材料以及打印的目的不同,生物打印平台构建形式也多种多样。世界上仅有少数几个发达国家有能力开发商品化细胞生物打印机,虽然这种生物打印机具有产品集成化程度高,操作简便等优点,但由于打印材料有限,打印平台软硬件受专利保护,无法根据打印实际需要进行参数修改和软硬件升级、优化,商品化细胞生物打印机并未得到广泛应用。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质构成,没有血管、神经和淋巴,几乎没有自我修复能力。一旦发生软骨损伤往往导致关节功能不可逆损害,最终引起骨关节炎发生,严重影响生活质量。软骨损伤修复尚无理想的治疗手段,软骨组织工程联合应用生命科学和工程制造的方法人工合成软骨组织,是当前最有希望解决软骨缺损修复困境的方法。分层构建组织工程软骨是软骨组织工程领域内的研究热点,强调从结构和功能上模拟天然软骨分层变化的规律。在哺乳动物关节软骨组织中,都存在着软骨细胞密度由软骨浅层至深层成梯度下降的分布规律,这是关节软骨发育和力学环境共同作用的结果,是关节软骨重要的分层结构特点之一。复习文献,国内外尚无研究关注构建具备仿生软骨细胞密度梯度分布规律的组织工程软骨。本研究期望自主建立挤压式水凝胶细胞生物打印机验证平台,初步掌握3D生物打印核心技术,尝试通过生物打印技术构建具备仿生软骨细胞密度梯度分布的组织工程软骨,验证生物打印技术在软骨组织工程中的应用,观察软骨细胞密度梯度分布生物学作用,探索一种分层构建组织工程软骨的新策略。方法本研究利用开源软硬件资料尝试自主搭建挤压式水凝胶生物打印验证平台,硬件系统包括:Prusa i3三维打印机移动系统,数控微量凝胶挤压系统;软件应用包括:三维电脑辅助设计软件(CAD软件)Solidworks、切片软件Slic3r、打印机上位控制软件Repetier-Host;选用3ml螺旋接口注射器作为水凝胶容器(生物打印墨水墨盒),25#平头针头作为挤压成型喷头,10%猪膝关节软骨II型胶原蛋白盐酸(0.15M)水溶胶作为打印墨水;安装Prusa i3三维打印机移动系统和数控微量凝胶挤压系统构成挤压式水凝胶生物打印验证平台,使用Solidworks软件设计三维实体模型,在切片软件Slic3r中设置打印层厚、打印条带走形方向及打印速度等参数,分割三维实体模型生成连续的二维轮廓,生物打印机在生成的Gcode代码文件控制下完成水凝胶打印,打印成型的II型胶原溶胶块置于37℃孵箱内30分钟完成交联;本研究通过生物打印技术构建具备仿生软骨细胞密度梯度分布的组织工程软骨,实验参考正常成人膝关节股骨髁软骨中软骨细胞总体密度约为1×107cell/m L,关节软骨浅、中、深三层细胞密度之比约3:2:1,使用复合不同软骨细胞密度的10%II型胶原蛋白水溶胶作为生物墨水,设计A组(细胞总体密度约为2×107cell/ml)、B组(细胞总体密度约为1×107cell/m L)、C组(细胞总体密度约为0.5×107cell/m L)三组组织工程软骨,每组分别构建具有仿生软骨细胞密度梯度分布和细胞均匀分布的两类细胞分布形式组织工程软骨,体外培养,分别于第0、1、2、3周取材,进行细胞学、生化、组织学等相关检测,对比分析仿生软骨细胞密度梯度分布和细胞均匀分布的两类组织工程软骨,验证生物打印技术,观察仿生细胞密度梯度分布的生物学意义。结果挤压式水凝胶生物3D打印验证平台得到初步建立,挤压头与三维运动系统匹配,系统运行平稳,打印过程全程可控,通过优化打印参数,3D细胞生物打印过程对细胞活性无明显影响;挤压式水凝胶生物3D打印平台能够实现仿生软骨细胞密度梯度分布组织工程软骨模型的构建,组织工程软骨体外培养3周,RT-q PCR结果显示:组织工程软骨中软骨细胞基因COL1A1持续低水平表达且出现下调趋势,基因COL2A1和ACAN表达水平随培养时间延长呈上调趋势,且具有统计学差异;核酸定量法测定组织工程软骨细胞总量结果显示:各时间点A、B、C三组中两类组织工程软骨(细胞均匀分布组织块与细胞梯度分布组织块)细胞总量无统计差异,随培养时间延长各组组织工程软骨细胞总量均出现无统计学意义的下降趋势;组织工程软骨样本GAG定量结果显示:体外培养第1周,A、B、C三组GAG总量与支架中细胞总体密度呈正相关,A组GAG含量最高,C组最低;培养第2、3周,C组GAG总量仍然最低,A组和B组GAG含量无统计学差异,为评估单个细胞GAG合成活性,分别将各组GAG总量与细胞总数标准化处理,体外培养第1周,各组间单细胞GAG合成量无统计学差异,在第2、3周,A组单细胞GAG合成量最低,B组具有最高的单细胞GAG合成量,B组中两类细胞分布组织块单细胞GAG合成量无统计差异,但B组细胞密度梯度分布组织块单细胞GAG合成量与A、C两组有统计差异,培养第3周,B、C两组中细胞均匀分布组织块单细胞GAG合成量有统计差异;免疫组化染色及阿尔新兰染色结果显示:免疫组化阳性染色细胞呈棕黄色,免疫组化阴性染色细胞呈蓝色,GAG成分被阿尔新兰染成蓝色,组织工程软骨中绝大多数软骨细胞表现为II型胶原蛋白阳性染色,一部分软骨细胞表现为PRG4阳性,只有少数软骨细胞出现I型胶原阳性染色,细胞密度梯度组软骨细胞新和成的II型胶原蛋白、PRG4和GAG成分呈现梯度分布规律,由浅层至深层逐渐减少。结论在熟悉并掌握生物3D打印相关基本原理和各系统软硬件组成基础之上,综合应用机械自动控制技术和生命科学理论,能够根据具体生物墨水和实际打印需要,利用开源软硬件资料自主设计并建立挤压式水凝胶生物打印验证平台,通过仿生细胞分布组织工程软骨模型的建立,验证了挤压式水凝胶生物打印验证平台能够实现软骨细胞在水凝胶支架中精确的空间定位,通过优化支架中细胞种植密度和分布模式能够提高细胞活性,研究结果表明生物打印仿生密度梯度分布组织工程软骨是一种分层构建组织工程软骨的新策略。