叶绿体是藻类和高等植物光合反应的场所,是由包围可溶基质的被膜和高度特化的类囊体膜组成。由类囊体膜包围的是一个狭窄连续的整体空间,叫做类囊体腔。自从菠菜的类囊体腔蛋白质组被首次分离鉴定后,人们对这个亚细胞器在光合作用的调节和保护功能的研究越来越多。蛋白质组学研究预测拟南芥类囊体腔含有80-200个蛋白。这些蛋白分别具有光合电子传递、放氧、蛋白折叠、蛋白酶等生物学功能,表明类囊体腔在光合结构的进化、优化、累积和修复等过程中,可以保证其自身在多变和胁迫环境下正常运转。后又发现在类囊体腔具有核酸代谢和氧化还原调节方面的证据,就更加丰富了类囊体腔的功能,人们对这个亚细胞器功能的认识也越来越深刻。但到目前为止,在水稻中对类囊体腔相关蛋白功能研究的报道只有两个:在拟南芥和烟草中异源表达OsCYP20-2和FKBP16-3可提高植株对非生物环境胁迫的能力。因此,研究水稻类囊体腔蛋白的功能对丰富水稻基因功能研究将会具有重要意义,同时也有可能会发现一些对水稻育种方面有价值的基因。　　在本研究中,我们鉴定了一个与拟南芥AtTLP具有53％同源性的水稻类囊体腔蛋白OsTLP27(OryzasativaThylakoidlumenprotein,27kDa),含有257aa,理论分子量为27kDa。通过反向遗传学手段和生理生化分析对该蛋白进行了系统的研究,主要结论如下:　　①OsTLP27基因编码一个拟南芥类囊体腔蛋白同系物(AtTLP),蛋白含有一个DUF1499结构域;　　生物信息学分析表明OsTLP27的同源基因在高等植物中广泛分布,可见该基因在植物生长发育中的作用十分重要。聚类分析表明单子叶和双子叶TLP蛋白在进化分析树中存在两个分支。BLAST序列比对发现OsTLP27与拟南芥类囊体腔蛋白基因AtTLP(At4g24930)具有53%的同源性。OsTLP27基因在亲缘关系上,相比双子叶植物,与单子叶植物进化关系更近。在植物质体数据库(PPDB)中搜索OsTLP27,发现其蛋白N端含有一个50aa的叶绿体转移肽和一个DUF1499结构域,可见OsTLP27的功能有待深入研究。　　②OsTLP27主要在叶片和叶鞘等绿色组织中表达,且受节律控制;　　利用定量PCR检测了OsTLP27在日本晴不同组织中的表达,这其中包括苗期叶片,分蘖期叶片和根,抽穗期叶片、叶鞘、根和花器官、成熟期叶片、叶鞘、茎和幼胚,结果显示OsTLP27主要在绿色组织中表达,表明其可能参与光合作用。利用半定量RT-PCR检测了OsTLP27在24h光照/24h黑暗条件下mRNA水平,结果表明OsTLP27在叶片中的表达受到节律控制。　　③OsTLP27是一个类囊体腔外周蛋白。　　构建了35S::OsTLP27-GFP融合表达载体,瞬时转化烟草原生质体,利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位的瞬时表达绿色荧光,结果表明OsTLP27定位于叶绿体中。利用叶绿体subfraction标记蛋白抗体和OsTLP27特异抗体研究OsTLP27在叶绿体subfraction上的定位,结果表明OsTLP27存在于类囊体膜上。酶保护实验表明OsTLP27锚定在类囊体膜外周(腔侧)。　　④过表达OsTLP27增强水稻光化学效率并重塑叶绿体结构;　　OsTLP27超表达提高转基因植株叶绿素含量并增强其光化学效率。最大光化学效率(Fv/Fm)、PSII量子产额(ΦPSII)、电子传递率(ETR)和光化学淬灭(qP)等都增强;过表达还导致叶绿体相关基因的转录水平升高,基粒个数增多并且结构变大,光复合体组成形式也因此发生了变化;　　⑤OsTLP27间接参与水稻光合作用;　　OsTLP27的RNA干扰研究表明转基因植株的光合作用受阻,Westernblot结果表明参与光合作用的蛋白积累受到影响。当转基因植株在含有蔗糖的培养基上生长时表型无明显变化,但当转移到土壤中生长一段时间后,植株表型矮小,叶色偏黄。如果OsTLP27的转录水平低于野生型20%,干扰植株不能在土壤中存活。　　⑥OsTLP27可能具有分子伴侣功能;　　酵母双杂交分析表明OsTLP27与核糖体转运RNA蛋白RpL31和一个醛酮氧化还原酶(Aldo-ketooxidoreductase)家族蛋白(AKRFP)相互作用。以OsTLP27诱饵质粒筛选酵母文库,共筛选到两个存在相互作用的蛋白:RpL31和AKRFP蛋白。酵母共转化实验进一步表明了OsTLP27蛋白与RpL31和AKRFP蛋白存在相互作用。构建荧光双质粒共侵染洋葱表皮细胞,发现OsTLP27蛋白与RpL31和AKRFP蛋白确实是在生物体内(invivo)发生了相互作用。因此基于互作蛋白分析,我们推测OsTLP27可能作为一个分子伴侣参与AKRFP的质体转运。　　这些结果表明OsTLP27是一个影响叶绿素体结构和功能的新蛋白。　　OsDET1保守区单个氨基酸改变和其转录水平的提高导致了水稻高叶绿素含量的表型。但是它的功能获得型突变(gain-of-function)对突变体生理水平上的影响还需要系统研究。在本文中,我们对突变体的生理生化特性进行了研究分析,以下是主要发现:　　①温和电泳及二向SDS-PAGE和后续蛋白质谱分析,以及Westernblot结果表明很多光系统蛋白水平都上调表达;　　②突变体叶绿体超微结构变化明显,其基粒个数增加,垛叠片层增厚;　　③叶绿素荧光参数表明突变体PSII光合活性增强;　　从上述结论我们发现OsDET1对突变体进行了广泛的修饰,以一种正调控的方式参与水稻叶绿体结构和功能调节,本研究的OsDET1基因还可以应用在遗传育种中。