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黑豆具有乌发、补肾、解毒、延年益寿等功效。现代中医学也表明黑豆可乌发、活血解毒、明目、软化血管、治疗不孕等。从营养学角度看,黑豆富含蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等多种营养成分,同时又具有多种生物活性物质,如异黄酮,皂苷,花色苷,花色素等。本研究以黑豆种子为原材料,分离纯化得到黑豆脂氧合酶(black soybean lipoxygenase,bsLOX),同时发现bsLOX还具有β-葡萄糖苷酶活性,可以将黑豆种皮中的花色苷水解为等分子花色素和葡萄糖,进而,水解的花色素可以抑制脂氧合酶及糖苷酶活性,这为深入研究脂氧合酶的生物学功能及寻找天然的脂氧合酶抑制剂提供了理论基础。黑豆脂氧合酶的纯化采用缓冲液浸提、硫酸铵沉淀、透析、阳离子交换层析及凝胶层析等方法进行;纯化的蛋白分别以亚油酸钠和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(β-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside,pNPG)为反应底物鉴定其脂氧合酶活性和β-葡萄糖苷酶活性;荧光光谱分析了三种花色素(矢车菊素、矮牵牛素和飞燕草素)对bsLOX结构和酶活性的影响;高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析了bsLOX对花色苷(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素葡萄糖苷)的水解作用;花色素对bsLOX的β-葡萄糖苷酶活性的影响。实验结果表明,采用上述方法分离纯化获得了一种兼有β-葡萄糖苷酶活性的脂氧合酶(bsLOX)。纯化的bsLOX在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)图谱显示单一条带,根据SDS-PAGE计算其分子质量约为95kDa。酶活性分析表明,纯化的bsLOX以亚油酸钠为底物时,酶活力为13 U;当以pNPG为底物在405 nm波长处检测到了对硝基苯酚的生成,从而推测bsLOX具有β-葡萄糖苷酶活性;荧光分析显示花色素(矢车菊素、矮牵牛素和飞燕草素)与bsLOX能够相互结合;高效液相色谱实验结果表明bsLOX可以降解花色苷(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷)为花色素(矢车菊素、矮牵牛素),由于降解作用不完全,继而发现花色素能抑制bsLOX的酶活性。综上所述,我们提出,bsLOX是黑豆中的一种兼具β-葡萄糖苷酶活性的蛋白质,而花色素可能是天然的bsLOX抑制剂。