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由于传统化石能源不可再生且储量有限,寻找和开发新型廉价、清洁、可再生的能源是全球急需解决的问题。当前最热门的三大可再生能源是太阳能、风能和生物质能,其中利用微生物发酵纤维素等生物质发酵生产乙醇、甲烷、氢气等生物燃料不仅可以解决环境污染问题,还可以打破能源分布不均等问题。近年来,嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacteria）因为其水解纤维素能力强、戊糖转化率高、底物谱广等优势成为了热门的纤维素乙醇生产菌。Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27是本课题组自主筛选得到的一株革兰氏阳性嗜热厌氧杆菌,能利用多种己糖、戊糖和二糖,其中木糖可以和葡萄糖,果糖和甘露糖等多种己糖共利用,但阿拉伯糖与葡萄糖之间却存在CCR现象,且木糖的利用速率仅为葡萄糖的42.67%,该菌的糖耗能力和产醇能力比目前工业上使用的乙醇生产菌要低,限制了其工业化应用。因此,研究嗜热厌氧杆菌的碳代谢阻遏机制,挖掘木糖及葡萄糖代谢途径的相关基因及调控机制,对强化SCUT27底物高效利用具有重要的指导意义。本研究构建T.aotearoense SCUT27的ccpA敲除菌SCUT27/△ccpA,结果显示:ccpA敲除可以解除阿拉伯糖与葡萄糖、阿拉伯糖和果糖之间的分解代谢阻遏现象,但菌体OD600下降27.34%,总糖耗下降35.07%。通过构建工程菌SCUT27/△hpr和SCUT27/△crh对其功能进行验证:hpr敲除无法获得正确条带的工程菌,说明HPr对菌体的生存非常关键无法进行全敲除;工程菌SCUT27/△crh不能解除阿拉伯糖和葡萄糖、阿拉伯糖和果糖之间的分解代谢物阻遏,也不影响菌体生长以及对糖的消耗。将HPr蛋白涉及分解代谢物阻遏调控的46位丝氨酸突变成丙氨酸,得到工程菌SCUT27/△hpr/hprS46A,该菌可以解除阿拉伯糖与葡萄糖和果糖之间的分解代谢物阻遏现象。对前期以木糖或葡萄糖为唯一碳源的转录组数据进行挖掘,基因簇V5181054-1059可能是木糖代谢相关基因,包括木糖异构酶（xylA）、木酮糖激酶（xylB）和ABC transporter,另有三个可能的木糖代谢途径的转录调控因子rok（V5181060）,lacI（V5181062）和含PRDs结构域的转录激活因子mtlR（V5182192）。反转录PCR结果表明V518 1054-1059基因簇为一个共转录单元。构建工程菌SCUT27/△rok,SCUT27/△lacI,SCUT27/△mtlR,其发酵数据显示,MtlR是木糖代谢的正调控因子,灭活mtlR后,工程菌利用木糖的能力下降67.56%,基因xylA和xylB的转录水平分别下降约39.67%,ABC transporter的转录水平下降86.93%。过表达mtlR后,基因xylA和xylB的转录水平均提高约44.75%,木糖利用能力提高25.71%。接着对转录组进一步分析,找到了4个在葡萄糖下高表达的转运蛋白,分别为糖转运ABC transporter（trans）、果糖转运PTS系统（pts1）、果糖转运PTS系统（pts2）及葡萄糖转运PTS系统（pts3）。单独敲除上述4个转运蛋白对葡萄糖利用的影响均不显著;果糖主要是通过pts1（V5180375-0376）转运并受到其上游DeoR家族转录激活因子（V5180378）的正调控。将SCUT27的HPr蛋白第15位组氨酸突变成天冬氨酸得到工程菌SCUT27/△hpr/hprH15D,葡萄糖消耗能力仅下降18.02%,由此可见,葡萄糖主要是通过非PTS途径转运。为提高葡萄糖通过PTS转运的能力,将SCUT27自身的HPr蛋白替换成丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC824的HPr,工程菌在以葡萄糖为唯一碳源时,葡萄糖利用速率提高了 63.15%,在木糖和葡萄糖混合培养下,葡萄糖利用速率提高68.18%,木糖利用速率提高46.15%。综上所述,本文验证了T.aotear 7oenseSCUT2中阿拉伯糖和葡萄糖、阿拉伯糖和果糖之间的分解代谢物阻遏为CcpA依赖型,且该调控过程中的辅阻遏蛋白是HPr。在SCUT27中木糖代谢途径由转录因子MtlR激活果糖主要是通过PTS（V5180375-0376）转运,葡萄糖主要是通过非PTS途径转运。通过替换C.acetobutylicum ATCC824的HPr到SCUT27中可以显著提高葡萄糖和木糖的共利用能力和速率,为提高嗜热厌氧杆菌的糖利用速率和强化木糖和己糖共利用能力提供了新思路。