目的:慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis,CAG)属于胃癌前疾病,尤其是伴有肠上皮化生、异型增生等胃癌前状态者,癌变可能性更大,其发生癌变与细胞增殖密切相关。Hippo/YAP信号通路及其相关蛋白对细胞增殖有调控作用,作为胃癌发病及治疗的新靶点,日益受到关注。化浊解毒方在治疗CAG的长期临床应用中,也取得了显著的疗效。本研究通过观察化浊解毒方对CAG大鼠模型的一般情况、胃黏膜组织病理学改变、胃黏膜组织中Hippo/YAP信号通路的主要成分YAP、TEAD以及与其调节相关的上游Merlin蛋白、下游Survivin蛋白表达水平的变化,探讨化浊解毒方治疗CAG的作用机制,为浊毒理论治疗CAG的临床应用提供实验依据。方法:将70只体重在250-300g健康清洁级雄性SD大鼠适应性喂养1周后,用随机数字表法抽取12只作为正常组(Normal Group,N),剩余58只作为模型组(Model Group,M),采用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)自由饮用,雷尼替丁灌胃,结合饥饱失常联合造模法建立CAG大鼠模型。造模20周后,N组和M组均随机抽取2只观察造模效果,确认模型复制成功后,按照随机原则将模型组分为5组:自然恢复组(Spontaneous Recovery Group,SR)、维酶素组(Vitacoenzyme Group,VG)、化浊解毒方高剂量组(High-doze Group,HG)、化浊解毒方中剂量组(Moderate-doze Group,MG)、化浊解毒方低剂量组(Low-doze Group,LG),各10只(造模过程中有6只大鼠死亡)。从造模成功后的第2天开始,N组、SR组给予10ml/kg/d蒸馏水灌胃,VG组给予10ml/kg/d维酶素混悬溶液灌胃,生药量为0.006g/ml,HG、MG、LG组给予10ml/kg/d化浊解毒方中药悬浊液灌胃,生药量分别为2.8g/ml、1.4g/ml、0.7g/ml,灌胃期间观察大鼠体重、毛发色泽、齿爪色泽、精神状态、食欲状态、大便情况等一般情况的变化,共灌胃治疗12周。末次给药后禁食、禁水48h,麻醉后取病变明显处胃黏膜组织并处死。采用HE染色方法观察胃黏膜组织病理学改变,免疫组织化学(SP法)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印记法(Western Blot)检测胃黏膜中Hippo/YAP的YAP、TEAD及上游Merlin、下游Survivin的基因和蛋白表达水平。使用SPSS 21.0统计学软件对所有数据进行分析。结果:1一般情况造模阶段,N组大鼠的一般状态与实验前无异。M组大鼠造模后一般状态发生改变,其毛色晦暗无光泽,脱毛严重,精神萎靡,反应迟缓,活动量少,喜扎堆,嗜蜷卧,食量减少,体重明显下降,粪便质软或不成形。治疗阶段,经药物灌胃治疗后,VG组、HG组、MG和LG组大鼠的一般情况均有改善,其中HG组大鼠的一般情况有明显好转,VG组、MG组大鼠的一般情况也有好转,LG组、SR组大鼠的一般情况改善不明显。2胃黏膜组织病理学观察肉眼观察:造模阶段,N组大鼠的胃黏膜组织表面光滑,呈粉红色,黏膜皱襞排列整齐;M组大鼠的胃黏膜组织表面粗糙,部分存在颗粒状隆起,呈灰白色,可见大量点片状红斑及出血点,少数出现糜烂,黏膜皱襞低平、稀少或走向紊乱,部分甚至消失。治疗阶段,HG组、MG组、VG组大鼠的胃黏膜病变有明显改善;LG组、SR组大鼠的胃黏膜病变部分改善。组织病理学观察:造模阶段,N组黏膜层厚度正常,上皮细胞完整,固有腺体数量适中、排列整齐,无炎性细胞浸润;M组黏膜层变薄,上皮细胞变性、坏死、脱落,固有腺体减少,排列紊乱,黏膜肌层变厚,间质存在炎性细胞浸润。治疗阶段,HG组、MG组、VG组大鼠黏膜厚度适中,上皮细胞无明显的变性坏死,固有腺体数量适中,排列较整齐,间质存在少量炎性细胞浸润;LG组、SR组黏膜也有部分改善。3胃黏膜中Hippo/YAP信号通路及相关蛋白表达水平比较3.1胃黏膜中Hippo/YAP信号通路表达水平比较3.1.1胃黏膜中YAP的表达水平比较SR组YAP的光密度平均值、最后灰度值和m RNA均高于N组,差异具有统计学意义(P<0.01),且均高于HG组、MG组、LG组和VG组,差异具有统计学意义(P<0.01);不同剂量中药组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA随中药剂量的升高而降低,HG组低于MG组、LG组,差异有统计学意义(P<0.01),MG组低于LG组,差异有统计学意义(P<0.01);西药治疗组和中药组比较,HG组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA低于VG组,差异有统计学意义(P<0.01),MG组与VG组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA相近,差异无统计学意义(P>0.05);N组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA均为最低,低于VG组、MG组、LG组比较有显著差异(P<0.01),N组的光密度平均值低于HG组,差异有统计学意义(P<0.01),N组的最后灰度值和m RNA与HG组相近,差异没有统计学意义(P>0.05)。3.1.2胃黏膜中TEAD的表达水平比较SR组TEAD的光密度平均值、最后灰度值和m RNA均高于N组,差异具有统计学意义(P<0.01),且均高于HG组、MG组和VG组,差异具有统计学意义(P<0.01),SR组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA与LG组相近,差异没有统计学意义(P>0.05);不同剂量中药组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA随中药剂量的升高而降低,HG组低于MG组、LG组,差异有统计学意义(P<0.01),MG组低于LG组,差异有统计学意义(P<0.01);西药治疗组和中药组比较,VG组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA表达高于HG组、MG组,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);N组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA均为最低,低于VG组、MG组、LG组比较有显著差异(P<0.01),N组的光密度平均值低于HG组,差异有统计学意义(P<0.01),N组的m RNA和最后灰度值与HG组相近,差异没有统计学意义(P>0.05)。3.2胃黏膜中Hippo/YAP信号通路上游调节蛋白Merlin的表达水平比较SR组Merlin的光密度平均值、最后灰度值和m RNA均低于N组,差异具有统计学意义(P<0.01),且均低于HG组、MG组、LG组和VG组,差异具有统计学意义(P<0.05);不同剂量中药组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA随中药剂量的升高而增高,HG组高于MG组、LG组,差异有统计学意义(P<0.01),LG组与MG组蛋白的光密度平均值、最后灰度值和m RNA相近,差异无统计学意义(P>0.05);西药治疗组和中药组比较,HG组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA高于VG组,差异有统计学意义(P<0.05);N组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA最高,高于VG组、HG组、MG组、LG组,差异有统计学意义(P<0.01)。3.3胃黏膜中Hippo/YAP信号通路下游调节蛋白Survivin的表达水平比较SR组Survivin的光密度平均值、最后灰度值和m RNA均高于N组,差异具有统计学意义(P<0.01),且均高于HG组和VG组,差异具有统计学意义(P<0.01),SR组与LG组、MG组蛋白的光密度平均值、最后灰度值和m RNA相近,差异无统计学意义(P>0.05);不同剂量中药组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA随中药剂量的升高而降低,HG组低于MG组、LG组,差异有统计学意义(P<0.01);西药治疗组和中药组比较,VG组的光密度平均值、最后灰度值和m RNA低于HG组,差异有统计学意义(P<0.05);N组蛋白的光密度平均值、最后灰度值和m RNA均为最低,低于VG组、HG组、MG组、LG组比较有显著差异(P<0.01)。结论:1化浊解毒方能够改善CAG大鼠的一般情况,修复受损的胃黏膜。2 CAG大鼠的胃黏膜组织中YAP、TEAD及Survivin的表达水平升高,Merlin表达缺失。3化浊解毒方能显著改善CAG大鼠胃黏膜病理变化,与其能降低胃黏膜组织中YAP、TEAD及Survivin的基因及蛋白表达水平,增加Merlin的表达水平有关,提示化浊解毒方通过调控Hippo/YAP信号通路及上游Merlin和下游Survivin蛋白的表达水平而对CAG起到治疗作用。4高剂量的化浊解毒方在抑制YAP、TEAD异常表达,增加Merlin表达水平方面优于维酶素。