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荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)是莲科莲属水生植物,为中国十大传统名花之一,荷花花姿优雅,花色美丽,观赏价值极高,且全株多个组织或器官可入药或食用,具有很高的经济价值。目前荷花虽已有红、粉、白、黄、复色等多种花色的品种,但大多数品种为深浅不一的粉色系列,色调相对单一。迄今,有关荷花花色形成分子调控机制方面的研究较少,荷花花青素苷合成途径相关的调控机制尚不明了,阻碍了荷花花色分子育种工作的进一步推进。有鉴于此,本研究以红、粉、白、黄四个花色品种为研究对象,首先进行了不同品种花瓣的花色表观分析、色素含量测定,然后克隆了荷花花青素苷合成途径中的7个关键结构基因,并分析了这些基因在不同品种不同花发育时期(蕾期、初花期、盛花期、末花期)的花瓣,同一品种不同组织(花瓣、叶、叶柄、雄蕊、心皮)中的表达差异,探讨了花青素苷合成途径关键结构基因对荷花花色形成的调控机制,为进行荷花花色改良及创新的分子育种奠定了重要的理论基础。1不同品种不同花发育时期花瓣的花色表型分析和色素含量測定通过分析不同品种不同花发育时期花瓣的色差值、总类黄酮含量、总花青素含量变化,可知,红色及粉色品种表观花色的变化与总花青素含量的变化基本一致,但白色及黄色品种各花发育时期花瓣总花青素含量几乎为0;黄色品种不同花发育时期总类黄酮的含量高于其它品种。由此可推测红、粉色荷花花色的形成主要受花青素积累的影响,黄色荷花花色形成与黄酮醇等积累有关。2花青素苷合成途径中的关键结构基因的克隆及序列分析采用基因克隆的方式从荷花中分离出花青素苷合成途径中的7个关键结构基因。经测序比对,这7个关键结构基因分别为NnCHS、NnCHI、NnF3H、NnF3’H、NnF3’5’H、NnDFR、NnANS MiCHS开放性阅读框(ORF)为1170bp,编码389个氨基酸；NnCHI的ORF长度为630 bp,编码209个氨基酸;NnF3H的ORF为996 bp,编码331个氨基酸；NnF3’H的 ORF 为 1542bp,编码 513 个氨基酸;NnF3’5’的 ORF 为 1524bp,编码507个氨基酸;NnDFR的ORF为1029 bp,编码342个氨基酸;NnANS的ORF为1080 bp,编码389个氨基酸。在氨基酸序列的同源性比对分析中,荷花F3H及DFR与其他物种的同源性较低,荷花CHS、CHI、F3’H、F3’5’H、ANS与其他物种相关基因编码的氨基酸序列的同源性较高;系统发育树分析结果表明,荷花F3H、ANS与其他物种相关蛋白的亲缘性较远。对7个基因编码的蛋白质的基本结构进行预测,结果显示,荷花F3’H可能为亲水性蛋白；荷花CHS、CHI、F3H、DFR、ANS为酸性蛋白;荷花CHS、CHI、F3’H、DFR为稳定性蛋白;蛋白质的基本二级结构由a螺旋、延伸链、β转角、随机卷曲组成;7个蛋白质均具有相应的蛋白结构域。3荷花花青素苷合成途径中关键结构基因的表达模式首先,通过对8个看家基因的稳定性进行评价,发现荷花不同花色品种及不同花发育时期qPCR基因表达研究中最适的内参基因为EFla和ACT。在确定合适内参基因的基础上,我们对荷花花青素苷合成途径中7个结构基因的时空表达进行了检测。结果发现,在红色荷花品种中,7个关键结构基因的表达量随着花发育期呈现先增加后减少的趋势,在盛花期表达量较高;粉色荷花品种中,F3’H在不同花发育期的表达量几乎为0,其它基因则随着花发育期表达量逐渐减少;白色荷花品种不同花发育期,DFR及ANS的表达量几乎为0;黄色荷花品种不同花发育期的花瓣中几乎检测不到DFR的表达,但CHI在蕾期出现高量表达。在不同组织间,7个基因在花瓣中的表达量均显著高于其它组织。综上,在荷花花青素合成途径中,CHI、F3’H、DFR、ANS的表达量可能对花青素的合成及积累起着重要的调控作用,从而影响荷花花色的形成。