[研究背景及目的]乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染在发展中国家和亚太地区的流行情况非常严重,我国亦是HBV感染高发地区,人群携带率约10%,由HBV引起的暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure, FHF)和慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF),其病情凶险,死亡率高达70%以上,临床上缺乏特异而有效的治疗靶点和干预手段,除非实施肝移植,绝大部分患者预后不良。病毒诱导的肝衰竭的发病机制十分复杂,近年来我们对Ⅲ型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain3, MHV-3)诱导的小鼠暴发型肝衰竭和HBV诱导的慢加急性肝衰竭(HBV-induced acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF)进行研究中证实,NK细胞与肝衰竭的发生发展密切相关。肝脏中含有丰富的NK细胞,其作为机体天然免疫的第一道防线发挥着至关重要的作用。此外NK细胞还具有调节肝脏损伤,募集外周血淋巴细胞等功能。近期研究证实,在小鼠肝炎模型、感染HBV以及HCV的患者体内,NK细胞均能介导肝损伤。在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝衰竭模型以及小鼠巨细胞(MCMV)模型中,NK细胞可以大量杀伤被病毒感染的肝脏细胞。Balb/cJ小鼠感染MHV-3后,NK细胞在肝脏迅速大量募集和活化,且杀伤活性显著增强,分泌IFN-γ和TNF-α的水平也显著上调,而且可通过Fas-FasL和NKG2D-NKG2DL途径损伤肝细胞,表明肝脏NK细胞在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝衰竭中可能发挥重要作用。但是,在天然免疫阶段,机体如何调剂NK细胞,特别是如何抑制NK细胞的活性的免疫学机制尚不清楚。髓源性抑制细胞(MDSCs)是一种骨髓细胞,具有高度的异质性。并且由于其最初发现时具有免疫抑制性,因此而得名。在病理条件下,如癌症、急性和慢性感染、创伤、创伤后应激、移植、糖尿病、以及一些自身免疫性疾病等条件下,MDSCs可以大量增殖,并且迅速进入外周血,并最终募集于相应的靶器官以及组织中。小鼠MDSC细胞可以用CD11b+Gr-1+作为标示。已有研究证实,该群细胞可以抑制T细胞的增殖,抑制T细胞的活化。但是并不是所有的MDSCs细胞均表现为免疫抑制性,已有研究证实在肝脏疾病模型中,LY6C+MDSCs可以激活NK细胞表达活化性受体NKG2D。表达CD11b+Gr-1+的细胞也并不完全等价于MDSCs,他还包括成熟的中性粒细胞,炎症单核细胞,肿瘤坏死因子以及诱导型一氧化氮合酶介导的DC细胞(Tip-DC).现有研究证实,部分MDSCs不是简单的被激活的炎性单核细胞或者中性粒细胞的前体,而是具有强大免疫抑制性的特殊免疫调节性细胞。MDSCs在适应性免疫阶段对T细胞活性的抑制已经得到了广泛的实验论证。其主要的机制为依赖精氨酸酶-1,环氧化酶-2,前列腺素E2,NO(一氧化氮),活性氧(ROS)的上调介导对T细胞活性的抑制。另外,可以通过产生生长转化因子-β(TGF-β)以及耗竭半胱氨酸,调节T细胞表面L型受体的表达等途径抑制T细胞的活性。另外,有研究证实,在天然免疫阶段,MDSCs可以调节NK细胞的免疫学活性。在荷瘤小鼠模型中,MDSCs可以抑制NK细胞分泌能够杀伤肿瘤细胞的细胞因子。除此以外,MDSC细胞可以抑制NK细胞分泌IFN-γ,以此达到抑制NK细胞活性的目的。而上述免疫抑制功能,均需依靠细胞-细胞相互接触完成。另外有研究表明,表达CD11b+Gr-1+F4/80+的MDSCs可以抑制NKT细胞的活性,另外可以通过表达RAE-1(维甲酸早期诱导因子-1),激活NK细胞。已有文献很少有提及在病毒感染状态下,MDSCs对NK细胞的免疫调节以及其相应的机制。本实验从体内、体外两方面阐述在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝衰竭模型中,MDSCs中LY6G+细胞亚群对NK细胞活性的抑制作用以及作用机制。另外对MDSCs的另一亚群LY6Gneg细胞对NK细胞的活化作用做了简单的探讨。并且对于ICAM-1与CDllb之间的相互作用导致NK细胞以及MDSCs在肝脏中的募集机制做了一定的研究。具体研究目标如下：1.建立小鼠暴发性肝炎模型①在疾病进程中动态观察小鼠骨髓,外周血,肝脏,脾脏内MDSCs的分布。②研究肝脏MDSCs的分群③研究MDSCs LY6Ghi亚群对NK细胞的免疫抑制性作用。④研究MDSCs LY6neg亚群对NK细胞的活化作用。2.探讨NK细胞以及MDSCs在肝脏中的募集机制动态观察肝脏细胞ICAM-1的表达以及NK细胞、MDSC细胞CDllb的表达。[研究方法]1.采用MHV-3腹腔途径感染Balb/cJ小鼠建立暴发性肝衰竭模型。2.流式细胞术检测MHV-3感染0、24、48、72h后的Balb/cJ小鼠肝脏、脾脏、外周血和骨髓中MDSCs的相对数量(MDSC/MNC)。3.多色流式细胞术检测感染MHV-3前后,肝脏中MDSCs的分群,以及其分群特点。4.体外共培养条件下MDSCs LY6Ghi亚群对NK细胞的抑制性作用。检测NK细胞共培养后NKG2D(MFI)的表达,INF-y的分泌以及对YAC-1细胞的杀伤能力。通过抗体阻断的方式,研究LY6Ghi MDSCs对NK细胞的抑制性机制。5.用细胞过继实验以及抗体阻断实验,观察在体内环境下MDSCs对NK细胞活性的影响,以及观察小鼠的生存曲线。6.在体外共培养的条件下MDSCs LY6Ghi亚群对NK细胞的活化性作用。检测NK细胞共培养后NKG2D(MFI)的表达,INF-y的分泌以及对YAC-1细胞的杀伤能力。检测LY6Ghi MDSCs RAE-1的表达。7.流式细胞术检测感染MHV-3前后(48h)小鼠肝脏细胞ICAM-1的表达情况。检测NK细胞以及MDSCs CDllb的表达情况。8.在体内环境下,用抗体阻断的方法阻断ICAM-1,观察小鼠暴发性肝衰竭模型的生存曲线,以及感染病毒48h肝脏病理变化。[实验结果]1.在正常小鼠肝脏内,MDSCs分为2个亚群即：Ly6Chi Ly6Gneg MDSCs亚群以及Ly6Cint Ly6Gneg MDSCs亚群。在感染MHV-348小时,小鼠肝脏MDSCs明显分为3个亚群：Ly6Chi Ly6Gneg MDSCs亚群,Ly6Cint Ly6Gneg MDSCs亚群,Ly6Cint LY6Ghi MDSCs亚群.Ly6Cint Ly6Ghi MDSCs具有SSChi(较高的侧向散射)这一特性,并且具有环状核即分叶核。Ly6Cint Ly6Gneg MDSCs具有SSCint特性,Ly6Chi Ly6Gneg MDSCs具有SSClow特性。这两亚群细胞更具有淋巴细胞不分叶核这一特性。2.在感染MHV-3病毒48小时后,小鼠外周血、脾脏、骨髓的单个核细胞中MDSCs的比例发生变化,即表达CD11b+Gr-1+细胞相对数量发生变化。在外周血中,由30.7%上升至45.7%。在脾脏中,由16.5%下降至9.7%。在骨髓中,由63.7%下降至38.4%。3.在体外条件下将取自正常小鼠肝脏的NK细胞与感染48小时MHV--3小鼠肝脏的LY6G hi MDSCs共培养12小时,NK细胞表达NKG2D(MFI)降低,分泌IFN-γ减少,对YAC-1细胞的杀伤作用均降低。用Transwell,抗体阻断方法,证实,LY6Ghi MDSCs对NK细胞的抑制性作用是通过非细胞-细胞接触式,并且依赖TGF-β以及NO途径。4.在体内用Gr-1抗体阻断,以及LY6Ghi MDSCs过继方法证实。正常小鼠过继LY6Ghi MDSCs后,小鼠肝脏NK细胞表达NKG2D (MFI)下降。且过继LY6Ghi MDSCs,抗体阻断Gr-1均可以延长小鼠暴发性肝衰竭模型小鼠的生存时间。5.在体外条件下将取自正常小鼠肝脏的NK细胞与感染48小时MHV-3小鼠肝脏LY6c细胞共培养12小时。NK细胞表达NKG2D(MFI)上升。且流式细胞学检测,小鼠感染MHV-3,48小时后,LY6Cint-hi LY6GnegMDSCs表达RAE-1上升。6.流式细胞学检测感染MHV-348h后,小鼠肝脏细胞ICAM-1(MFI)上升。小鼠肝脏NK细胞,LY6Ghi MDSC细胞表达CD11b(MFI)上升。抗体阻断小鼠暴发性肝衰竭模型小鼠ICAM-1,小鼠生存时间延长。[结论]1、本研究首次利用MHV-3诱导的暴发性肝衰竭小鼠模型探讨了肝脏MDSCs在病毒诱导的肝衰竭中作用。着重探讨了MDSC细胞亚群LY6Ghi MDSCs对NK细胞的免疫学抑制作用。2、本研究首次在MHV-3诱导小鼠暴发性肝衰竭模型中,感染小鼠肝脏内MDSCs的分群以及细胞动力学改变。3、研究发现,Balb/cJ小鼠感染MHV-3后,MDSCs在肝脏迅速大量募集。其中LY6Ghi MDSCs亚群,可以通过TGF-p以及NO途径抑制NK细胞表达NKG2D以及分泌IFN-y,抑制NK细胞的杀伤作用。另外LY6Cint-hi LY6Gneg MDSCs可以通过RAE-1途径,激活NK细胞表达NKG2D(MFI)。上述实验表明肝脏MDSCs在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝衰竭中可能发挥重要免疫调节作用。这一研究发现有助于深入理解病毒诱的暴发性肝衰竭的发病机制,亦为后续疾病的干预治疗提供了新的契机。4、本研究进一步利用MHV-3诱导的暴发性肝衰竭小鼠模型探讨了肝脏MDSCs以及NK细胞迁移的分子机制,探讨了ICAM-1, CDllb趋化受体-配体模式的作用,为后续疾病的分子干预治疗提供了重要的靶点。