桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的提取分离及其活性的研究

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桑叶,为桑科桑属植物桑树(Morusalba.L)的叶子。我国安徽、浙江、江苏、四川、湖南等地均有栽培,历代中医文献对其功能多有记载,认为其具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血的功用。近年来,人们对桑叶的化学成分、生理成分进行了研究,发现桑叶中营养丰富,含有人体必需的氨基酸、维生素、无机盐、黄酮类、生物碱类等多种功能性成分。特别是生物碱1-脱氧野尻霉素(1-deoxynoiirimycin,DNJ),是植物中唯有桑叶含有的。1-脱氧野尻霉素可以同小肠中的麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等2-糖苷酶结合,使二糖不能进一步分解为单糖被吸收,从而明显地抑制了食后血糖值急剧升高的现象,延缓糖尿病的发作和恶化。本实验为探讨提取工艺的科学性,以DNJ含量为指标,通过正交试验优选其提取工艺的最佳条件,从而为实现桑叶DNJ的工业化生产提供科学依据,具有一定的实际应用价值。 首先,研究了桑叶中DNJ的测定。本文采用DNJ衍生化后通过紫外扫描和高效液相对其进行了定性;建立了桑叶中DNJ含量的测定方法:加入wagner试剂为显色剂,并在紫外条件下扫描,得出其最大吸收波长为284nm,用此方法的精密度为3.5%,加样回收率为90.68%,并且该方法在一个小时以内相对稳定。 利用单因素试验和正交试验研究了桑叶中DNJ的提取工艺。确定酸水提取法最佳工艺条件为:桑叶粉末粒度60目、提取温度55℃、pH3盐酸溶液、料液比1:20、提取时间1.5h,所得提取液经分析可知,DNJ得率0.062%,纯度为19.7%。 确定酸性乙醇提取法最佳工艺条件为:桑叶粉末粒度60目、提取温度55℃、pH值为1的75%乙醇溶液、料液比1:30、提取时间1.5h,所得提取液经分析可知,DNJ得率0.064%,纯度为20.3%。 在以上的基础上追加超声波强化对桑叶中DNJ的提取工艺条件:物料粒度60目、pH3盐酸溶液、料液比1:20、超声功率150W,超声温度60℃,超声时间25min,提取2次,DNJ得率0.083%,纯度26.3%。 以不同季节的桑叶为研究对象,考察了不同季节桑叶中DNJ的含量变化。结果表明:桑叶中生物碱DNJ的含量是与生长季节有关的,3~5月份的含量较低,6月份逐渐增高,8月份最高,9、10月份又逐渐降低。这些变化显示,桑叶中生物碱DNJ含量与气候温度也有关,这初步揭示了桑叶中DNJ含量随季节变化的规律。为了对桑叶中DNJ进行纯化,本文以桑叶中DNJ的静、动态饱和吸附量、洗脱率为考察指标,从六种不同大孔树脂优选了NKA-9对其脱附。最佳工艺条件:上样浓度0.278mg/ml,上样流速2BV/h、径高比1:25,用80%乙醇以2.5 BV/h流速洗脱,通过纯化,纯度由20.3%增加到58.4%。同时也进行了001×7阳离子交换树脂的纯化效果考察。最佳工艺条件:10×300mm层析柱,树脂用量19g,最佳上样液浓度0.32mg/mL,流速为2BV/h,用0.5mol/L氨水以1.5BV/h的流速洗脱,通过精制,纯度由20.3%增加到47.6%。 为了研究桑叶中DNJ的降血糖的作用,以与人体接近的动物小肠(猪小肠)内的蔗糖酶为对象,对桑叶中提取出来的DNJ进行了体外活性的研究。结果表明:猪小肠蔗糖酶的酶活力与pH值有密切关系,在pH6.6时,酶表现出最强的活力,加入抑制剂后酶活力下降。在37℃、pH6.6,当酶和底物的浓度恒定时,抑制作用随着抑制剂浓度增大而增大。同时,当酶和抑制剂的浓度一定时,抑制作用随着底物浓度增大而减小。确定了抑制作用类型为竞争性抑制。以蔗糖为底物,桑叶中DNJ对猪小肠蔗糖酶的K<,i>为9.15×10<-2>mol/L。抑制剂与酶的亲和力比底物与酶的亲和力要高上4倍左右。
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