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糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GH)是一类负责催化含糖化合物中糖苷键断裂的酶，在自然界中广泛存在。GH18家族几丁质酶和GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是其中重要的两类，它们都采用了底物辅助保留催化机理。
GH18家族几丁质酶广泛分布于细菌、真菌、线虫、植物、节肢动物和哺乳动物体内，主要负责水解环境中或生物体自身的几丁质，在细胞营养、病原入侵、胚胎发育、昆虫蜕皮和免疫防御等多种生命活动中都发挥了重要的作用。对昆虫而言，几丁质是其外骨骼、气管和中肠围食膜的重要结构组分，因此几丁质酶对于昆虫的生长发育至关重要。在昆虫众多的几丁质酶中，Ⅱ分支几丁质酶(ChtⅡ)是其中结构域数目最多、分子量最大的一种。鳞翅目昆虫中，ChtⅡ与Ⅰ分支几丁质酶(ChtⅠ)和几丁质酶h(Chi-h)共同参与蜕皮过程中表皮几丁质的水解，虽然ChtⅠ和Chi-h的结构和功能已经得到了很好的研究，但ChtⅡ的结构仍不清楚。目前ChtⅡ的研究集中在基因水平，通过RNA干扰使ChtⅡ基因表达下调会导致昆虫蜕皮障碍并死亡，因此ChtⅡ可以作为一个潜在的杀虫剂靶标，而ChtⅡ抑制剂的研究也有助于新型农药的开发。
GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是生物体内负责水解O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)翻译后修饰的糖苷水解酶，对于维持细胞内正常的O-GlcNAc水平至关重要。O-GlcNAc是真核生物中一种重要的动态翻译后修饰，参与细胞内包括信号转导、基因转录翻译和细胞循环在内的多种重要生理过程，O-GlcNAc水平的失调与多种疾病密切相关，如糖尿病、神经退行性疾病和癌症等。O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶不仅能通过调控O-GlcNAc水平直接影响相关的生理过程，而且能通过O-GlcNAc与磷酸化修饰的相互作用间接影响更多的信号通路。因此，O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶的抑制剂在研究和治疗O-GlcNAc失调引发的相关疾病方面具有潜在的应用价值。
本论文以农业害虫亚洲玉米螟来源的GH18家族几丁质酶(OfChfⅡ)和人来源的GH84家族的O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶(hOGA)作为研究对象，主要获得以下结果:
(1)获得了OfChtⅡ的基因和蛋白序列
根据不同昆虫ChtⅡ的保守序列设计引物，经过同源序列获取从亚洲玉米螟成虫的cDNA中克隆获得了OfChtⅡ的基因序列9077bp，GenBank登录号为MF034108.1。其中编码区为157-8943位核苷酸，编码2929个氨基酸，GenBank登录号为ASO66823.1。序列分析发现OfChtⅡ有5个属于GH18家族的特征结构域以及7个几丁质结合结构域。5个GH18家族特征结构域中有三个结构域的催化残基发生突变，只有靠近C端的第二和第三个GH18结构域有催化活性。
(2) OfChtⅡ截短体的水解活性和结构特征
全长的OfChtⅡ不稳定且难以在体外重组表达，因此我们重组表达了四个截短体:OfChtⅡ-C1，OfChtⅡ-C2，OfChtⅡ-C1C2和OfChtⅡ-B4C1。水解活性实验发现，OfChtⅡ截短体对小分子底物的水解活性低，而对高聚底物的活性随着结构域数目的增加而升高，说明OfChtⅡ全长在水解高聚底物时具有很大的潜力。
通过悬滴蒸汽扩散法获得了OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2蛋白及蛋白-底物的晶体结构，二者的蛋白结构具有很高的结构相似性，都具有一个（β/α）8 TIM桶组成的核心结构域和一个几丁质插入结构域。OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2的表面都存在着一条芳香族残基组成的长且深的底物结合裂缝，兼具OfChtⅠ和OfChi-h底物结合裂缝的结构特征。但是，OfChtⅡ的活性口袋外部缺乏有利于晶态几丁质结合的结构元件，不过它的多个几丁质结合域可能会弥补这个缺陷。
(3) OfChtⅡ小分子抑制剂的筛选和抑制机理研究
筛选获得了OfChtⅡ的多个小分子抑制剂，通过复合物晶体对部分抑制剂的抑制机理进行了研究。其中壳八糖(GlcN)8占据了底物结合裂缝的-3到+5位点，主要通过糖环与芳香族残基的疏水堆积作用结合;联吡啶并嘧啶类化合物2-8-S2结合在底物结合裂缝的+1和+2位之间，两个2-8-S2分子通过π-π堆积与两个保守的色氨酸形成一种双侧夹心结构。
(4) hOGA的小分子抑制剂设计和抑制机理研究
设计合成了一系列具有新型骨架结构的hOGA小分子抑制剂，包括NAG-噻唑啉的2-位衍生物，甘露糖构型的NAM-噻唑啉衍生物和硫苷-萘酰亚胺杂合物分子。测定了化合物对GH20家族和GH84家族糖苷水解酶的活性和选择性，通过结构生物学和分子对接阐述了部分化合物的抑制机理。其中甘露糖构型的NAM-噻唑啉衍生物的结合方式与NAG-噻唑啉类似，噻唑啉环伸向活性口袋内部。GH20家族和GH84家族糖苷水解酶对硫苷-萘酰亚胺杂合物分子表现出不同的结合模式。
GH18家族几丁质酶广泛分布于细菌、真菌、线虫、植物、节肢动物和哺乳动物体内，主要负责水解环境中或生物体自身的几丁质，在细胞营养、病原入侵、胚胎发育、昆虫蜕皮和免疫防御等多种生命活动中都发挥了重要的作用。对昆虫而言，几丁质是其外骨骼、气管和中肠围食膜的重要结构组分，因此几丁质酶对于昆虫的生长发育至关重要。在昆虫众多的几丁质酶中，Ⅱ分支几丁质酶(ChtⅡ)是其中结构域数目最多、分子量最大的一种。鳞翅目昆虫中，ChtⅡ与Ⅰ分支几丁质酶(ChtⅠ)和几丁质酶h(Chi-h)共同参与蜕皮过程中表皮几丁质的水解，虽然ChtⅠ和Chi-h的结构和功能已经得到了很好的研究，但ChtⅡ的结构仍不清楚。目前ChtⅡ的研究集中在基因水平，通过RNA干扰使ChtⅡ基因表达下调会导致昆虫蜕皮障碍并死亡，因此ChtⅡ可以作为一个潜在的杀虫剂靶标，而ChtⅡ抑制剂的研究也有助于新型农药的开发。
GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是生物体内负责水解O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)翻译后修饰的糖苷水解酶，对于维持细胞内正常的O-GlcNAc水平至关重要。O-GlcNAc是真核生物中一种重要的动态翻译后修饰，参与细胞内包括信号转导、基因转录翻译和细胞循环在内的多种重要生理过程，O-GlcNAc水平的失调与多种疾病密切相关，如糖尿病、神经退行性疾病和癌症等。O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶不仅能通过调控O-GlcNAc水平直接影响相关的生理过程，而且能通过O-GlcNAc与磷酸化修饰的相互作用间接影响更多的信号通路。因此，O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶的抑制剂在研究和治疗O-GlcNAc失调引发的相关疾病方面具有潜在的应用价值。
本论文以农业害虫亚洲玉米螟来源的GH18家族几丁质酶(OfChfⅡ)和人来源的GH84家族的O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶(hOGA)作为研究对象，主要获得以下结果:
(1)获得了OfChtⅡ的基因和蛋白序列
根据不同昆虫ChtⅡ的保守序列设计引物，经过同源序列获取从亚洲玉米螟成虫的cDNA中克隆获得了OfChtⅡ的基因序列9077bp，GenBank登录号为MF034108.1。其中编码区为157-8943位核苷酸，编码2929个氨基酸，GenBank登录号为ASO66823.1。序列分析发现OfChtⅡ有5个属于GH18家族的特征结构域以及7个几丁质结合结构域。5个GH18家族特征结构域中有三个结构域的催化残基发生突变，只有靠近C端的第二和第三个GH18结构域有催化活性。
(2) OfChtⅡ截短体的水解活性和结构特征
全长的OfChtⅡ不稳定且难以在体外重组表达，因此我们重组表达了四个截短体:OfChtⅡ-C1，OfChtⅡ-C2，OfChtⅡ-C1C2和OfChtⅡ-B4C1。水解活性实验发现，OfChtⅡ截短体对小分子底物的水解活性低，而对高聚底物的活性随着结构域数目的增加而升高，说明OfChtⅡ全长在水解高聚底物时具有很大的潜力。
通过悬滴蒸汽扩散法获得了OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2蛋白及蛋白-底物的晶体结构，二者的蛋白结构具有很高的结构相似性，都具有一个（β/α）8 TIM桶组成的核心结构域和一个几丁质插入结构域。OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2的表面都存在着一条芳香族残基组成的长且深的底物结合裂缝，兼具OfChtⅠ和OfChi-h底物结合裂缝的结构特征。但是，OfChtⅡ的活性口袋外部缺乏有利于晶态几丁质结合的结构元件，不过它的多个几丁质结合域可能会弥补这个缺陷。
(3) OfChtⅡ小分子抑制剂的筛选和抑制机理研究
筛选获得了OfChtⅡ的多个小分子抑制剂，通过复合物晶体对部分抑制剂的抑制机理进行了研究。其中壳八糖(GlcN)8占据了底物结合裂缝的-3到+5位点，主要通过糖环与芳香族残基的疏水堆积作用结合;联吡啶并嘧啶类化合物2-8-S2结合在底物结合裂缝的+1和+2位之间，两个2-8-S2分子通过π-π堆积与两个保守的色氨酸形成一种双侧夹心结构。
(4) hOGA的小分子抑制剂设计和抑制机理研究
设计合成了一系列具有新型骨架结构的hOGA小分子抑制剂，包括NAG-噻唑啉的2-位衍生物，甘露糖构型的NAM-噻唑啉衍生物和硫苷-萘酰亚胺杂合物分子。测定了化合物对GH20家族和GH84家族糖苷水解酶的活性和选择性，通过结构生物学和分子对接阐述了部分化合物的抑制机理。其中甘露糖构型的NAM-噻唑啉衍生物的结合方式与NAG-噻唑啉类似，噻唑啉环伸向活性口袋内部。GH20家族和GH84家族糖苷水解酶对硫苷-萘酰亚胺杂合物分子表现出不同的结合模式。