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第一部分MANF在非酒精性脂肪性肝病动物及细胞模型中的表达变化目的:探讨MANF在非酒精性脂肪性肝病中的表达变化方法:选取8周龄雄性C57BL/6J(WT)小鼠并随机分成普食组(HFD 0W)及高脂组,其中高脂组又分为高脂喂养8周(HFD 8W),12周(HFD 12W)及16周(HFD16W),每组包含3只小鼠。喂养结束后留取各组小鼠肝脏组织,检测各组MANF的mRNA及蛋白水平表达变化。无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)刺激HepG2细胞作为对照组,用0.5mM游离脂肪酸(FFAs)对HepG2细胞进行不同时间点(24h,48h,72h)的刺激,形成体外肝细胞脂肪变性模型。刺激相应时间点后收取细胞用于检测MANF的表达变化。结果:与普食组相比,高脂喂养8周小鼠肝脏MANF的表达水平增加(P<0.05),而随着喂养时间延长,高脂喂养12周及16周小鼠肝脏MANF的表达水平逐渐下降(P<0.05或P<0.01)。细胞结果与动物实验一致,与对照组相比,MANF的表达水平在高脂刺激早期阶段(24h)短暂增加(P<0.01或P<0.001),而在刺激48h及72h其表达逐渐减少(P<0.05或P<0.01)。结论:在NAFLD动物及细胞模型中,MANF的表达在早期阶段均呈现出暂时性的增加,随着刺激时间的延长,其表达出现逐渐下降的趋势。这一表达改变提示了应该进一步探讨MANF在NAFLD中的作用。第二部分MANF改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病的发生发展目的:探讨MANF在高脂饮食诱导NAFLD中的作用方法:46只8周龄雄性WT小鼠随机分成普食组(n=22)及高脂组(n=24),分别普食或高脂喂养16周后,普食组分为:对照普食组(AAV-GFP/NCD组,n=5),过表达MANF普食组(AAV-MANF/NCD组,n=5),阴性对照普食组(AAV-NC/NCD组,n=6),下调MANF普食组(AAV-MANF sh RNA/NCD组,n=6);高脂组分为:对照高脂组(AAV-GFP/HFD组,n=6),过表达MANF高脂组(AAV-MANF/HFD组,n=6),阴性对照高脂组(AAV-NC/HFD组,n=6),下调MANF高脂组(AAV-MANF sh RNA/HFD组,n=6)。分别通过尾静脉注射腺相关病毒以干扰小鼠体内肝脏MANF的表达,继续对各组小鼠喂养6周。喂养期间每隔两周定时测定小鼠体重,每隔四周定时测定小鼠空腹血糖。于尾静脉注射后第5周及6周分别行IPGTT及IPITT,试验结束后继续喂养一周并收集各组小鼠眼球血测定血浆TG、TC含量,肝脏组织用于HE及油红O染色,并测定肝脏TG、TC、ALT、AST及脂肪酸代谢关键酶相关基因的表达水平。结果:小鼠注射MANF过表达病毒后肝脏MANF表达明显增加(P<0.01),而注射下调MANF病毒后未能成功减少肝脏MANF的表达,因此后续只分析过表达组结果。高脂组小鼠体重及空腹血糖均较普食组小鼠明显增加,而过表达MANF后轻微改善高脂组小鼠体重及血糖,但不具有统计学差异。IPGTT及IPITT结果显示普食组小鼠血糖无明显变化,而在高脂组小鼠中,过表达MANF后IPGTT曲线下面积较对照组明显减少(P<0.05)。HE及油红O染色结果提示,高脂喂养小鼠出现明显的肝脏脂肪变性,同时过表达MANF后显著改善高脂喂养小鼠肝脏脂肪变性。此外,与AAV-GFP/HFD组相比,AAV-MANF/HFD组血清中TG及TC含量明显下降,肝脏TG水平显著下降(P<0.05或P<0.01),肝脏ALT及AST水平无明显改变。相关基因表达结果提示,与AAV-GFP/HFD组相比,AAV-MANF/HFD组中脂肪酸摄取相关基因(CD36、FABP-1)m RNA水平明显下调,脂肪酸β-氧化相关基因(PPARα、CPT-1α)m RNA水平显著上调(P<0.01或P<0.001)。结论:高脂饮食诱导下,过表达MANF基因能抑制肝脏脂肪生成,降低血清TG、TC含量,并改善小鼠肝脏脂肪变性,在NAFLD的发生发展中起着一定的保护作用。第三部分MANF抑制游离脂肪酸诱导的肝细胞脂肪变性及潜在的机制研究目的:探讨MANF在游离脂肪酸诱导的肝细胞脂肪变性中的作用及相关机制研究方法:选取Hep G2细胞作为细胞模型,用0.5m M的FFAs(OA:PA=2:1)刺激Hep G2细胞诱导肝细胞脂肪变性模型。此外,构建MANF过表达慢病毒(Lv-MANF)及MANF下调慢病毒(Lv-sh MANF)细胞稳转株,用于体外干扰MANF的表达,并探索MANF在脂肪酸诱导的肝细胞脂肪变性中的作用。同时收集各组细胞用于转录组测序分析,探索潜在的机制。检测各组细胞内TG、TC含量以及脂肪酸代谢相关基因的表达水平。结果:油红O染色结果表明Hep G2细胞脂肪变性模型构建成功。转录组测序结果提示MANF基因与胆固醇代谢、糖异生、非酒精性脂肪性肝病等多种代谢过程密切相关。在高脂刺激的Hep G2细胞中,过表达MANF改善肝细胞脂肪变性,降低细胞内TG及TC含量,同时明显下调脂肪酸及胆固醇合成相关基因(FAS、ACCα、SREBP-1C、HMGCR),脂肪酸摄取相关基因(CD36、FABP-1)的m RNA水平(P<0.05或P<0.01);而下调MANF加重肝细胞脂肪变性,增加细胞内TG含量,同时明显上调脂肪酸及胆固醇合成相关基因、肪酸摄取相关基因的m RNA水平(P<0.05或P<0.01)。与Lv-GFP+FFAs组相比,过表达MANF减少IRE1α、XBP1及XBP1s的表达水平,而下调MANF后增加了IRE1α、XBP1及XBP1s的表达水平(P<0.05或P<0.01)。结论:体外游离脂肪酸刺激下,MANF可改善肝细胞脂肪变性,减轻肝细胞内脂肪积聚,并抑制脂肪生成,而MANF对脂肪酸代谢的调控作用可能依赖于IRE1α/XBP1信号通路。