背景：脑胶质瘤是常见的颅内肿瘤之一,对人体健康有巨大的危害。脑胶质瘤的发生、发展是一个多步骤、多因素参与的过程,除了原癌基因的激活,抑癌基因的失活外,某些凋亡调控基因的异常表达在其中也起着重要作用,因此研究凋亡调控基因在脑胶质瘤中的作用,明确其作用机理,将为脑胶质瘤的诊疗提供重要的理论依据。Survivin是新近发现的凋亡抑制基因,它在多数肿瘤及胚胎组织中表达量较高,而在大多数正常组织中survivin均不表达,其表达产物具有独特的结构,并能够通过一系列途径抑制细胞凋亡或加速细胞分裂从而促进肿瘤细胞增殖,因而对肿瘤细胞的存活起着重要的保护作用。由于在肿瘤组织中survivin过量表达的高度特异性,以及它在恶性肿瘤细胞生存中的作用,因而它很可能是将抗细胞凋亡和细胞恶变直接联系起来的桥梁,因此survivin被认为是抗肿瘤治疗的一个重要靶点。另外,近年来随着RNA干扰技术的不断应用与成熟,其高特异性与有效性已经使它成为研究基因功能的一项非常重要的手段。那么,作为凋亡抑制蛋白,通过RNA干扰技术靶向抑制survivin的作用,能否抑制脑胶质瘤的生长,其机制又是什么?染色质组装因子1亚基A (Chromatinassembly factor 1 subunit A, CHAF1A),是组蛋白伴侣的成员之一。研究表明,CHAF1A在细胞增殖、DNA修复以及胚胎干细胞的后天调节中起着重要作用。肿瘤细胞的特点是细胞过度增殖以及原癌基因/肿瘤抑制子功能失调导致的DNA修复功能紊乱。已有研究报道,过度表达CHAF1A与乳腺癌细胞的形成发展密切相关。因此,CHAF1A被认为可能是多种肿瘤发病的驱动基因之一。然而目前CHAF1A在胶质瘤中的作用仍不清楚。为了解决以上问题,本课题首先应用RNA干扰技术,构建针对survivin基因的干扰shRNA,将其重组入腺病毒(survivin shRNA adenovirus vectors, Ad-survivin-sh RNA),并扩增纯化,分别在体内及体外研究阻断survivin表达对于胶质瘤细胞的影响。首先,培养人脑胶质瘤细胞系U251细胞,加入重组腺病毒进行转染,应用Hoechst33342染色及流式细胞术检测U251细胞凋亡；同时应用CCK-8法检测对U251细胞增殖的影响；PCR及Western Blot分别检测survivin基因及蛋白表达情况。进而建立裸鼠U251胶质瘤皮下模型,将重组腺病毒注入裸鼠脑胶质瘤处进行基因转染,观察肿瘤生长曲线,免疫组化检测survivin蛋白表达,TUN EL方法检测细胞凋亡。体内及体外结果显示,Ad-survivin-shRNA能够降低survivin基因及蛋白的表达,同时能够增加细胞凋亡,抑制细胞增殖及肿瘤生长。为了明确CHAF1A在胶质瘤中的作用,本课题选用122例人脑胶质瘤样本,用免疫组化的方法检测胶质瘤中CHAF1A表达水平；应用CRISPR/CAS9基因技术,以慢病毒为载体敲除胶质瘤细胞中的CHAF1A,检测对于细胞周期及凋亡的影响;同时检测了与CHAF1A的生物学功能有关的信号通路的变化。我们的研究表明,CHAF1A的表达水平与胶质瘤病人的预后有关,阻断CHAF1A的表达能够促进细胞凋亡,抑制胶质瘤细胞的增殖。通过本项研究,能够明确阻断survivin及CHAF1A的表达,对脑胶质瘤U251、U87细胞的侵袭力、细胞活性、凋亡等生物学行为的影响,为今后深入研究并应用于临床提供了理论和实验依据,为脑胶质瘤的治疗提出了新方法、新思路。目的：探讨survivin及CHAF1A对脑胶质瘤细胞的作用。方法：1.细胞培养人脑胶质瘤U251或U87细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养液中,于37℃、5%C02培养箱培养,隔日消化传代,期间观察细胞状态。于感染前一天收集对数生长期U251细胞,在计数板上计数并调浓度为105个/ml,接种于培养瓶内,培养箱过夜培养,待细胞达到70%-80%融合时进行病毒转染。2.病毒制备Survivin腺病毒是由吉凯公司设计制作。其合成序列参考已发表文献文献,具体序列为：sense,5’-GGACCACCGCATCTCTACA-3’; antisense, 5’-TGTAGAGATGCGGTGGTCC-3’。U251细胞按照浓度105 cells/ml培养过夜,然后根据合适的MOI值将Ad-su rvivin-sh RNA转染进入U251细胞。慢病毒购自上海吉凯公司。将携带有基因敲除CHAF1A的慢病毒转染进入培养的U251细胞或者U87细胞。所用序列分别为：sg-EGFP:51-GGTGAACCGCATCGAGCTGA-3’;sg-CHAF1A:5’-CCGACCTGTGGCGG CTCCCC-3’。3.病毒转染先将U251细胞培养液弃掉,以无血清DMEM液稀释腺病毒载体并加入96孔板中,置于孵箱,4h后换液,换为含10%灭活胎牛血清的DMEM完全培养液,继续培养24h后在倒置荧光显微镜下观察重组腺病毒载体携带的绿色荧光蛋白(GFP)的表达,人工计数检测Ad-survivin-shRNA腺病毒的转染效率,即绿色蛋白的阳性细胞数/细胞总数,确定最适感染复数MOI值。并在转染24h、48h、72h、96h使用倒置显微镜观察细胞形态。Ad-survivin-shRNA腺病毒按照MOI值分别为50,100,200,500,1000pfu/cell设组稀释病毒感染U251细胞；并设立阴性对照(不含干扰基因的腺病毒)及空白对照组。慢病毒转染：在U251、U87细胞培养液中加入Lenti-CAS9慢病毒,转染12h后更换培养液继续培养,3天后再加入sgRNA慢病毒,12h后换培养液,收集细胞进行后续研究。阴性对照组加入空慢病毒。U251细胞MOI=1,U87细胞MOI=5。4. Real-time PCR收集细胞,提取RNA并测浓度,同时用凝胶电泳及分光光度计的OD260/280比值判断RNA质量,将质量合格的RNA做反转录,最后做实时定量PCR检测内参actin及目的基因,并统计两者灰度值比值。5. Western blot收集细胞,将细胞重悬于RIPA裂解液中,冰上裂解30min后离心,上清液为蛋白提取液,蛋白定量后加入1×SDS上样缓冲液,反复吹打后98℃水浴5 min。冷却后进行SDS-PAGE分析,电泳结束后将蛋白转印至硝酸纤维素膜,用5%脱脂奶粉的TBS-T室温封闭1h,加入一抗,4℃放置过夜。次日加入二抗,室温孵育1 h。用增敏化学发光底物试剂(ECL)检测。6. Hoechst33342染色取对数生长期U251细胞悬液,加入24孔培养板使其终浓度为(2×105个/mL),培养过夜后加入重组腺病毒载体Ad-survivin-shRNA或空载体(阴性对照组),空白组不给予任何处理。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育4h后换液,于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养96h,4%多聚甲醛固定10min,加入Hoechst33342染液500ul,避光孵育5min,然后于倒置荧光显微镜下观察细胞核以判断细胞的凋亡状态(×100倍)。7.CCK-8测细胞增殖将处于对数生长期的U251按每孔100ul接种96孔板,置于细胞培养箱过夜培养。次日,将Ad-survivin-shRNA腺病毒载体及阴性对照病毒加入U251细胞,每组设三个复孔,以DMEM完全培养液做空白对照,再置于37。C、5%C02饱和湿度的条件下培养。分别于培养24、48、72、96 h时取出一块96孔板,每孔加入10 μl的CCK-8液,于37℃条件下孵育2h后,用酶标仪测定各孔在450 nm波长范围内的吸光度(A)值。根据实验结果数据计算细胞增殖抑制率,并绘制细胞增殖抑制曲线,分析药物作用的效果。细胞增殖抑制率(%)=(对照组A值一实验组A值)/对照组A值x100%。8.流式检测细胞凋亡取对数生长期细胞悬液,培养过夜后加入病毒载、阴性对照组病毒空载体,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下共同孵育4h后换液,于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养。48 h、72 h、96h后取出24孔板,吸尽培养液,置摇床上以PBS洗三次,每次5min,吸尽PBS然后各管加入195μlAnnexinV-PE结合液,再加入5μlAnnexin V-PE,轻轻混匀。室温避光孵育20分钟。300目滤网过滤细胞,上流式细胞仪检测Annexin V-PE阳性率。9.肿瘤细胞接种裸鼠六周大裸鼠在右前臂区域皮下注射U251细胞,每天测量肿瘤大小直至其直径达到5mm。将以上动物分为三组,分别在肿瘤组织中注射以下三种试剂：注射生理盐水组,注射Ad-survivin-shRNA组,注射空病毒载体组。每三天在肿瘤组织中注射一次,每两天测量一次肿瘤体积。肿瘤体积=肿瘤最长直径×宽度2(与最长直径垂直的最长直径)×0.5。10.免疫组化取材后及时固定,常规酒精脱水、用二甲苯透明、进蜡后石蜡包埋然后切片,厚度为4μm；经烤片,常规脱蜡,梯度酒精脱水后,于3%H2O2中浸泡15min,去除内源性的过氧化物酶；经过修复抗原后,于玻片上滴加正常羊血清工作液,室温封闭20min；滴加一抗,放入4℃冰箱,孵育过夜；滴加二抗,二抗是用辣根过氧化物酶标记,室温孵育1小时；DAB显色剂显色,流水充分冲洗；最后苏木素复染3 min,水洗；常规脱水,透明,干燥,中性树胶封片。11.TUNEL染色玻片室温下干燥,二甲苯浸洗2次,每次5min；用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min；用Proteinase K工作液处理组织15-30 min; PBS漂洗2次；每张切片滴加TdT酶混合反应液100μl,37℃反应60min(阴性对照不加TdT酶)；PBS漂洗3次；玻片干后加50μl converter-POD,37℃暗湿盒中反应30min；在组织处加100μlDAB底物,室温孵育10min；最后用苏木素复染；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。12.MTT法检测细胞增殖细胞转染CHAF1AsgRNA慢病毒或空病毒载体后孵育过夜,按照浓度为105/孔接种于六孔板,于每孔加MTT液50ug,放回孵育箱内孵育4小时,连续孵育5天,每组设3个复孔,每次实验重复三次,最后用分光光度计分别检测OD值。13.集落形成实验病毒感染细胞后培养过夜,按照浓度5X102/孔培养两周后,用PBS清洗,固定,最后用0.5%结晶紫染色。显微镜下观察集落数量。14.细胞周期检测细胞转染后,用胰蛋白酶消化后,用70%酒精固定,弃掉酒精,用PBS清洗三遍,重悬细胞,37℃孵育30min,最后放入FACSCalibur仪器,数据用CellQuest Pro软件进行分析。结果：1.腺病毒介导阻断Survivin对脑胶质瘤细胞的作用1.1 MOI值得确定在倒置荧光显微镜下观察GFP表达,确定转染率。MOI值为1000pfu/cell时,腺病毒的转染效率可达到95%以上,转染24小时细胞形态无明显变化,说明此剂量的腺病毒对细胞无明显直接损伤作用,48h后荧光强度进一步增强,因此最终确定Ad-survivin-shRNA腺病毒载体MOI=1000作为最适感染复数进行后续的实验。1.2腺病毒介导阻断Survivin对U251细胞形态的影响Ad-survivin-shRNA腺病毒感染U251细胞48h后细胞数目较空白对照组及阴性病毒对照组有明显的减少,且细胞形态发生改变,细胞间突触回缩,变少,细胞变圆悬浮,部分细胞出现空泡,随时间延长,形态变化更明显。阴性病毒对照组未见明显的形态学变化。1.3腺病毒介导阻断Survivin对U251细胞中survivin mRNA及蛋白表达的影响Real-time PCR结果发现,与阴性对照组U251细胞相比,survivin mRNA表达水平随Ad-survivin-shRNA作用时间延长有逐渐降低的趋势,阴性病毒对照组survivin mRNA表达水平无明显变化(P<0.05),说明Ad-survivin-shRNA阻断了U251中survivin mRNA的表达。Western blot的结果发现,与Real-time PCR结果一致,与对照组相比,随着转染时间的延长,survivin蛋白表达逐渐降低,进一步说明Ad-survivin-shRNA能够抑制体外培养的脑胶质瘤细胞U251中survivin的表达。1.4腺病毒介导阻断Survivin对U251细胞增殖的影响为了观察Ad-survivin-shRNA对于U251细胞增殖的影响,我们应用CCK-8法进行检测。结果发现,Ad-survivin-shRNA干扰U251细胞,细胞增殖明显受抑制。1.5腺病毒介导阻断Survivin对U251细胞凋亡的影响Hoechst33342染色结果显示,阴性对照组和空白对照组细胞核基本呈椭圆形或接近圆形,大小均一,淡蓝色；Ad-survivin-shRNA组可见细胞核固缩,凝集,染色高亮,说明经Ad-survivin-shRNA腺病毒干扰后U251细胞发生凋亡。接下来的流式结果显示,空白对照组U251细胞Annexin V-PE阳性率为0.8%±0.12,阴性对照组U251细胞Annexin V-PE阳性率为2.9%±0.1,Ad-survivin-shRNA组48h、72h及96h细胞AnnexinV-PE阳性率分别为9.4%±0.14、14.0%±0.12、28.9%±0.15,表明survivin被干扰之后,U251细胞发生凋亡现象。1.6腺病毒介导阻断Survivin影响脑胶质瘤的生长为了在研究腺病毒阻断Survivin在体内对脑胶质瘤细胞的影响,我们选择在裸鼠右前臂区域分别注射生理盐水、Ad-survivin-shRNA及空病毒载体。结果发现,注射Ad-survivin-shRNA组与空白对照组及阴性对照组相比,从第9天开始,脑胶质瘤体积增长明显减慢,说明阻断survivin能够抑制脑胶质瘤的生长。1.7腺病毒介导阻断Survivin对脑胶质瘤组织中survivin蛋白及细胞凋亡的影响为了观察Ad-survivin-shRNA对于脑胶质瘤组织中survivin蛋白的影响,在最后一次注射完毕后三天取出肿瘤组织,首先用免疫组织化学染色的方法检测survivin蛋白的变化。结果显示,与阴性对照组及空白对照组相比,survivin干扰组中survivin的蛋白表达明显降低(P<0.05)。进一步TUNEL染色结果显示,空白对照组瘤组织中TUNEL染色阳性细胞极少见；Negative组瘤组织中TUNNEL染色阳性细胞数与空白对照组差别不大;Ad-survivin-shRNA组TUNEL染色阳性细胞百分率明显增多,细胞凋亡指数增加,提示有大量凋亡发生。2. CHAF1A;对胶质瘤细胞的作用2.1CHAF1A表达水平与胶质瘤预后有关本实验应用122例胶质瘤患者外科手术切除的胶质瘤样本进行研究。我们首先用免疫组化方法,检测了122例样本中CHAF1A表达水平,结果显示CHAF1A蛋白表达越高,胶质瘤恶性程度越高,肿瘤体积越大。CHAF1A蛋白表达量与病人年龄及性别无关。另外,基因分析研究发现,低表达CHAF1A的病人较高表达CHAF1A病人生存期长。2.2用CRISPR/CAS9敲除CHAF1A能够抑制胶质瘤细胞的增殖我们应用CRISPR/CAS9敲除CHAF1A,选用MTT及集落形成的方法观察对于U251细胞及U87细胞增殖情况。我们的结果发现,敲除CHAF1A能够显著抑制细胞增殖,同时CHAF1A基因敲除后导致胶质瘤细胞集落数量减少,说明CHAF1A能够调控胶质瘤细胞的增殖。2.3用CRISPR/CAS9敲除CHAF1A能够诱导胶质瘤细胞的细胞周期及凋亡为了进一步探讨敲除CHAF1A后抑制细胞增殖的机制,我们检测了细胞周期。我们的结果显示,抑制CHAF1A能够诱导胶质瘤细胞向G1期分化。为了检测抑制CHAF1A对于细胞凋亡的影响,我们应用Annexine-V反应体系,发现转染CHAF1A基因敲除的慢病毒组,细胞凋亡数量显著增加。同时裂解的caspase-3和PARP显著增加。说明CHAF1A可能通过调节细胞周期及细胞凋亡影响胶质瘤细胞的生存。2.4敲除CHAF1A能够改变胶质瘤细胞中FOXO3a的活性为了明确参与敲除CHAF1A后抑制细胞增殖的细胞信号转导通路,我们用western blot的方法发现,转染基因敲除的CHAF1A组中Bcl-2, Mcl-1以及Bax没有明显变化,但Bim表达水平显著增高。进一步的研究发现,转染基因敲除CHAF1A慢病毒的U251及U87细胞中,FOXO3a (Ser253)磷酸化水平降低,但总FOXO3a并无变化,同时磷酸化Akt水平降低,说明Akt可能介导了磷酸化FOXO3a对于CHAF1A的调节作用。结论：1.腺病毒介导阻断survivin能够抑制体外培养的脑胶质瘤U251细胞的增殖；同时促进U251细胞凋亡；2.腺病毒介导阻断survivin能够抑制裸鼠体内胶质瘤的生长,降低胶质瘤组织中survivin的表达,促进胶质瘤组织细胞凋亡。3.过表达CHAF1A能够通过Akt/FOXO3a/Bim通路促进胶质瘤细胞增殖,抑制凋亡。意义：本课题的研究将使我们进一步明确survivin及CHAF1A在脑胶质瘤细胞中的作用；并为将来以survivin或者CHAF1A为目标的脑胶质瘤的治疗提供重要的实验依据。