论文部分内容阅读
背景:人类内源性逆转录病毒（Human Endogenous Retrovirus,HERVs）是人类进化过程中感染并整合到人类基因组中的逆转录病毒,其基因组约占人类总基因组的8～9%。在人体细胞生命周期中HERVs基因具有重要的生理功能,参与人类进化、生殖发育、免疫调控等。例如,在生殖发育过程中,HERVs基因直接影响了受精卵的着床、发育、基因转录与表达。人类基因组计划的研究结果显示,大多数HERVs基因都有突变、缺失或插入等变异存在,这使大部分HERVs失去了形成感染性病毒颗粒的能力。其中,K族（HERV-K）是最具有病毒生物学活性的一类HERVs基因,有复制能力的HERV-K如果被异常激活可能会导致疾病。HML-2是HERV-K中整合进人类基因组的时间最晚,生物活性最活跃的成员。研究发现,一些疾病的发生可能与HERV-K（HML-2）的转录上调、病毒蛋白的异常表达或HERV-K（HML-2）自身抗体的产生有关。目前已在多种自身免疫性疾病和恶性肿瘤患者中发现HERV-K（HML-2）的转录和表达产物。尽管这些研究报告的数量不断增加,但是仍未确定其中的因果关系。此外,另一部分研究表明,许多外源性病毒感染也可增加HERV-K（HML-2）的转录水平,这提示其他病毒感染能够激活人类基因组中的HERV-K（HML-2）前病毒,其转录与表达可能被其他病毒感染激活。人免疫缺陷病毒1型（Human Immunodeficiency Virus,HIV-1）是一种外源性的逆转录病毒,也可以整合到被感染者的基因组中,由于HIV-1与HERV-K（HML-2）同属逆转录病毒,两者的基因组元件非常相似,在HIV-1感染和复制过程中,一些中间产物或功能元件可能导致HERV-K（HML-2）的激活。与之相反,HERV-K（HML-2）的异常激活也可能影响HIV-1的复制调控。临床研究发现,70%的HIV-1感染者体内可检测到HERV-K（HML-2）相关抗体,在HIV-1脑病患者的脑组织中HERV-K（HML-2）转录水平升高。HIV-1感染者血浆中HERV-K（HML-2）部分RNA片段转录上调。然而,截止到目前,HIV-1感染与HERV-K（HML-2）转录和表达的内在关系还没有明确的结论。目的:（1）以我国不同HIV-1亚型感染者为研究对象,检测分析外周血淋巴细胞中HERV-K（HML-2）的转录水平是否与HIV-1病毒亚型和体内病毒载量存在相关性。（2）然后利用不同亚型HIV-1毒株体外感染不同组织来源的细胞模型,观察HIV-1感染所致细胞内HERV-K（HML-2）的转录水平变化,比较不同细胞模型感染后HERV-K（HML-2）的转录表达水平差异;（3）选择HERV-K（HML-2）转录表达水平上调明显的的细胞株,构建稳定表达HIV-1不同亚型毒株Tat蛋白的单克隆细胞株,确定HIV-1不同亚型毒株Tat蛋白激活HERV-K转录的差异。最终概括HIV-1感染在体内和体外激活HERV-K（HML-2）转录的作用,并初步探索可能的机制。方法:（1）收集未经抗病毒治疗HIV-1感染者和健康献血者的外周淋巴细胞（PBMCs）样本,通过RT-PCR扩增测序法鉴定HIV-1感染者的病毒基因亚型;采用实时定量PCR技术检测PBMCs中HERV-K（HML-2）的转录水平,分析不同HIV-1亚型间及HIV感染者与健康人之间HERV-K（HML-2）转录水平的差异。结合感染者流行病背景信息中的HIV病毒载量,分析病毒载量与HERV-K（HML-2）转录水平之间的相关性。（2）使用不同HIV-1亚型毒株（B亚型、CRF01＿AE）体外感染（MT2、H9、TZM＿bl等）不同细胞模型,确定HIV-1最适感染剂量（MOI）,在感染后不同时间分别取细胞及上清液。检测培养上清液中的HIV-1 p24抗原及细胞中的HIV-1RNA,确认HIV-1是否已成功感染及复制。使用实时定量PCR和RNAscope技术方法检测各组细胞感染模型HERV-K（HML-2）的转录水平,比较各组细胞及其感染前后的差异。（3）选择最适HIV-1感染的细胞模型,依托pLVX-TetOn系统构建可调控的稳定表达不同HIV-1亚型（B亚型、CRF01＿AE）Tat蛋白的细胞模型,探索不同HIV-1亚型的Tat蛋白对HERV-K（HML-2）转录激活的影响,比较不同HIV-1亚型的Tat蛋白对细胞内HERV-K转录水平影响的差异。结果:（1）获得106例HIV-1感染者的pol区基因序列、近似全长基因序列28条、5’端半分子序列15条,3’端半分子序列2条。结合感染者的流病信息最终鉴定了其中95例HIV-1感染者的病毒基因亚型,其中B亚型占41%（39/95）,CRF01＿AE占25.3%（24/95）,CRF07＿BC占24.2%（23/95）,CRF01＿AE/CRF07＿BC重组亚型9.5%（9/95）。通过近似全长基因序列及流行病学信息分析,确认一个由CRF01＿AE与CRF07＿BC重组的毒株为新型流行二代重组毒株（Circulate Recombinant Forms,CRF）,鉴定了其基因组嵌合结构及重组片段的来源,该基因型被美国HIV Databases,btf@lanl.gov数据库收录并命名为CRF102＿0107。（2）B亚型HIV-1感染者HERV-K（HML-2）gag区的转录水平相比健康对照显著上调（P<0.05）,而非B亚型毒株（CRF01＿AE、CRF07＿BC等）感染者的HERV-K（HML-2）pol区转录水平相比健康对照组显著上调（P<0.05）。感染者体内病毒载量与HERV-K（HML-2）各区的转录水平不存在明显的相关性（P>0.05）。（3）与未感染的细胞相比,HIV-1ⅢB毒株体外感染不同细胞株48小时后HERV-K转录水平上调,感染MT2细胞系后HERV-K（HML-2）转录水平上调约5倍（p<0.05）,感染H9和TZM＿bl细胞上调约1.5倍（P<0.05）。与未感染的MT2细胞相比,HIV-1 GX002株（CRF01＿AE重组亚型）感染MT2细胞48小时后HERV-K（HML-2）转录水平上调15倍（P<0.05）,GX002株感染导致HERV-K（HML-2）转录上调的水平显著高于ⅢB株和NL4-3毒株（P<0.05）。RNAscope的实验结果显示,感染24小时后ⅢB株、NL4-3株和GX002株HERV-K（HML-2）的转录均轻微上调,感染48小时后三组均上调明显,并且GX002组上调的程度更高,与实时定量PCR实验结果一致。（4）成功构建可调控稳定表达Tat蛋白的MT2细胞模型,包括pLVX-Tet On-NL4-3-Tat（B亚型）、pLVX-Tet On-GX002-Tat（CRF01＿AE重组亚型）和pLVX-Tet On-puro（空载对照）。发现不同亚型HIV-1 Tat蛋白对MT2细胞内HERV-K（HML-2）转录水平的影响存在差异（P<0.05）,B亚型和CRF01＿AE组分别上调了约4倍和2倍。结论:（1）发现和鉴定了1个新型二代流行重组HIV-1毒株（CRF）,被美国HIV Databases,btf@lanl.gov数据库收录并命名为CRF102＿0107。CRF102＿0107的发现为我国HIV防治工作提供了新的研究参考信息。（2）通过对HIV-1感染者和健康对照者的PBMCs检测,发现未经抗病毒治疗HIV-1 B亚型感染者体内HERV-K（HML-2）gag区的转录水平较健康人有所上调。HIV-1非B亚型（CRF01＿AE、CRF07＿BC）感染者体内HERV-K（HML-2）pol区的转录水平较健康人有所上调。不同基因亚型HIV-1感染者的HERV-K（HML-2）转录水平存在差异,需要进一步研究解释可能的机制。感染者体内病毒载量与HERV-K（HML-2）各区的转录水平不存在明显的相关性。（3）通过体外感染实验发现,不同细胞模型对HIV-1易感性不同,主要体现为相同时间内病毒复制能力不同,以MT2细胞系最为易感。不同亚型的HIV-1毒株感染导致MT2细胞HERV-K（HML-2）转录水平上调程度差异较大。CRF01＿AE毒株比B亚型毒株调节HERV-K（HML-2）转录水平上调的作用更强。（4）Tat蛋白可以激活MT2细胞内HERV-K（HML-2）的转录,且不同HIV-1亚型毒株的Tat蛋白上调HERV-K（HML-2）的能力存在差异,B亚型毒株相比CRF01＿AE毒株的Tat蛋白具有更强的调节HERV-K（HML-2）上调的作用。