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大鼠和小鼠是生物医学科研实验中用途最广和使用量最大的实验动物,实验动物的质量决定了科研结果的准确性和可靠性。目前,我国国家标准规定的SPF级实验大鼠和小鼠必须或必要检测的病毒项目是15种,除此之外,依然有不少病毒危害着实验鼠的健康。本研究选取5种暂未列入我国SPF级实验动物检测标准的大鼠和小鼠病毒,分别为大鼠细小病毒(Ratparvovirus,RPV)、大鼠微小病毒(Ratminute virus,RMV)、鼠脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMV)、小鼠轮状病毒(Murine Rotavirus,MRV)和大鼠疑似泰勒氏病毒(Theiler’s-likevirusofRats,TLV),以这些病原为研究对象,分别建立快速、准确的诊断方法,为实验动物的健康监护提供技术支撑。1.RMV和RPV双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立和应用以实验大鼠中常见的两种细小病毒RMV和RPV为研究对象,根据GenBank中已公布的RMV的NTU1株全基因组序列(GenBak登录号:JX627317.1),在3389～3589bp处设计引物和TaqMan探针。以及RPV的NTU1毒株全基因组序列(GenBank登录号:JX827169),在863-967 bp处设计引物和Taqaan探针。以构建的质粒标准品为模板建立荧光定量PCR检测方法,并对该鉴别检测方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对50份临床样品进行检测,并用ELISA的商品试剂盒进行验证,验证该方法的可靠性。结果显示,建立的RMV和RPV的双重荧光定量PCR方法标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,最低检测限可以达到30拷贝/μL,使用建立的荧光定量PCR方法和血清学ELISA检测试剂盒,同时对50只大鼠的肝脏样本和血清样品进行对应的检测,检测准确性为100%。因此,建立的RMV和RPV双重TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、灵敏的特点,适用于实验大鼠临床的监测。2.EMV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法建立根据EMV的PEC9毒株全基因组序列(GenBank登录号:DQ288856.1),设计一对特异性引物和TaqMan探针,建立EMV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,通过条件优化,对其特异性,敏感性,稳定性进行分析,结果显示,建立的荧光定量PCR标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99;敏感性最低检测限达到1拷贝/μL,高于普通PCR方法1000倍:其特异性强,常见的小鼠病毒株均无特异性扩增;重复性好,批内和批间变异系数均小于2%。利用该方法对上海市120份小鼠脑组织样品进行检测,未检测到阳性感染鼠,本研究为EMV病毒感染的分子检测、制定国家标准提供良好的方法。3.MRV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法建立根据MRV的EB-C8/G16P毒株VP1基因(Genbank登录号:KJ477127.1),设计引物和Taqman探针,构建扩增曲线,制作标准曲线,建立MRV荧光定量RT-PCR方法,并检测其特异性、敏感性和稳定性,从而初步建立检测方法并应用于动物房小鼠的检测。结果显示:建立的MRV荧光定量RT-PCR方法标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99;最低检测到10拷贝/μL,是常规PCR的100倍;与常见的小鼠病毒株均无特异性扩增;批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。所建立的MRV荧光定量RT-PCR方法具有特异、灵敏、准确的特点。对上海市120份小鼠肠道样品的检测的结果,为MRV的流行病学调查、及国家/地方标准的制定提供了可靠的借鉴。4.TLV的荧光定量RT-PCR检测方法的建立为了建立一种能在临床上快速、准确地检测TLV的方法,我们运用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)的技术,特异性地针对TLV病毒核酸进行检测。根据GenBank中TLV代表毒株NGS910的全基因组序列(GenBank登录号:AB090161.1),通过基因合成序列作为质粒标准品的模板,同时根据3622～3729 bp的特异性序列,设计引物和TaqMan性探针,优化反应体系及条件,进行qRT-PCR扩增,从而建立起了 TLV的TaqMan探针qRT-PCR方法,并对其灵敏度、稳定性和特异性进行评价。结果显示,建立的TLV的qRT-PCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R2值可达到0.99,灵敏度可达30个拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的100倍;且该qRT-PCR方法特异性强,重复性好,批内和批间变异系数均小于1%。因此,利用TaqMan探针法的优势所建立的TLV检测方法,具有操作简便、灵敏度高、特异性好等特点。本研究方法为TLV国家或地方标准的制定,提供了可靠的数据。本研究运用了荧光定量PCR技术在病毒检测学上的优势,对上述五种未列入国标的大、小鼠病毒,进行了检测方法的建立。同时结合血清学检测和普通PCR检测,校验本研究方法的可靠性和灵敏性。最终分别建立起了五种病毒的可靠荧光定量PCR检测方法。