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研究目的:非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是以肝脏脂肪过度沉积为主要特征的病理综合征,非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis,NASH）是NAFLD的炎症亚型,其发病机制复杂且尚无临床治疗药物,发现具有抗NASH活性的先导化合物并开展NASH治疗相关新机理研究具有重要意义。天然产物泽泻醇B是我国传统中药泽泻中的重要活性成份之一,其NASH治疗活性尚未见报道。本课题采用多种动物模型对泽泻醇B治疗NASH作用进行系统研究,并在明确泽泻醇B具有显著NASH治疗活性的基础上开展机理研究,重点探索了泽泻醇B通过调节体内失衡的视黄醇代谢稳态和RARα-PPAR-γ-CD36轴改善NASH的分子机制,为NASH治疗新药研发提供实验依据和理论基础。实验方法:建立高脂饮食联合四氯化碳（High-fat diet plus carbon tetrachloride,DIO+CCl4）诱导的小鼠NASH模型、胆碱缺乏（Choline-deficient and amino acid-defined,CDA）饮食诱导的小鼠NASH模型和高脂高胆固醇（High-fat plus high-cholesterol,HFHC）饮食诱导的金黄地鼠NASH模型,综合评价泽泻醇B抗NASH的体内药效。药效评价指标包括测定血清谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartic transaminase,AST）水平以及肝脏甘油三酯（Triglyceride,TG）和总胆固醇（Total cholesterol,TC）水平。采用苏木素-伊红染色对肝组织切片进行NAS病理学评分,采用天狼星红染色对肝组织切片进行胶原纤维定量分析,采用实时定量PCR和免疫印迹等实验方法检测肝脏炎症因子和纤维化标志物的表达水平。开展机制研究,对DIO+CCl4诱导NASH小鼠经泽泻醇B治疗后的肝脏进行基因测序检测。在游离脂肪酸（Free fatty acids,FFAs）诱导的小鼠原代肝细胞模型中检测泽泻醇B对细胞内TG累积和炎症因子表达的影响,采用荧光标记的脂肪酸类似物BODIPY-C16和活性氧标记物DCFH-DA分别检测泽泻醇B对游离脂肪酸摄入和氧化应激水平的影响。采用CD36 si RNA干扰和CD36质粒过表达研究CD36与泽泻醇B改善脂质累积、氧化应激和免疫调节的相关性,采用视黄酸受体α（Retinoic acid receptorα,RARα）si RNA和RARα过表达质粒阐明RARα与泽泻醇B抑制CD36表达的相关性。采用实时定量PCR检测泽泻醇B作用后NASH模型小鼠肝脏中视黄醇代谢关键酶的表达,并测定肝脏中全反式视黄酸（all-trans retinoic acid,at RA）的水平。实验结果:泽泻醇B长期口服给药可显著抑制DIO+CCl4诱导NASH小鼠血清ALT和AST水平以及肝脏TG水平,改善肝脏脂质累积和炎症浸润程度,降低肝脏NAS评分,抑制肝脏胶原沉积比例且降低肝纤维化标志物α-平滑肌动蛋白（α-Smooth muscle,α-SMA）和I型胶原蛋白a1（Collagen type 1a1,Col-1a1）的蛋白表达。在CDA饮食诱导的小鼠NASH模型和HFHC饮食诱导的金黄地鼠NASH模型中,泽泻醇B长期口服给药也可以显著抑制肝脏TG和TC水平,改善肝脏脂质累积和纤维化水平。基因测序结果提示,泽泻醇B可显著抑制DIO+CCl4诱导NASH小鼠肝脏中CD36的表达,并对视黄醇代谢通路具有显著调控作用。在小鼠原代肝细胞模型中,泽泻醇B可剂量依赖性抑制脂肪酸摄入,改善棕榈酸（Palmitate,PA）诱导的小鼠原代肝细胞中TG累积、氧化应激和炎症因子表达水平,并显著抑制c-JUN氨基末端激酶（c-JUN N-terminal kinase,JNK1/2）和核因子κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）蛋白磷酸化,且这些作用均依赖于泽泻醇B对CD36表达的下调。进一步研究表明,泽泻醇B可增加NASH模型小鼠肝脏和小鼠原代肝细胞中RARα基因表达,抑制HNF4α、PPAR-γ和CD36基因表达,RARα干扰可阻断泽泻醇B对小鼠原代肝细胞CD36基因表达的抑制作用,同时阻断泽泻醇B对小鼠原代肝细胞脂肪酸摄入、脂质累积和氧化应激的改善作用,提示泽泻醇B通过调节RARα-HNF4α-PPAR-γ转录调控通路抑制CD36表达。泽泻醇B对RARα并无直接激动活性,其上调RARα表达的作用可能与其增加NASH模型小鼠肝脏中全反式视黄酸的水平相关,而该作用可能与泽泻醇B显著增加NASH模型小鼠肝脏中视黄醇酯水解酶和视黄醛脱氢酶的基因表达水平相关。研究结论:本论文首次发现天然产物泽泻醇B对多种NASH动物模型具有显著治疗作用,该作用与泽泻醇B调控肝脏视黄醇代谢稳态、增加肝脏全反式视黄酸水平、上调肝脏中RARα表达、通过RARα-HNF4α-PPAR-γ通路抑制CD36表达并进而改善肝脏脂质累积、氧化应激及炎症因子表达等作用相关。本论文以泽泻醇B为探针,揭示了调控肝脏内源性视黄醇代谢紊乱或RARα-PPAR-γ-CD36轴作为NASH干预新策略的可能性,同时,也为以泽泻醇B作为先导化合物进行NASH治疗新药研发提供了实验基础和理论依据。