肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，也是全球恶性肿瘤致死的重要因素，据统计，在死亡的癌症患者中80％为非小细胞肺癌。毋庸置疑，在肺癌发病的分子机制方面，已从基因和转录水平进行了许多成功的研究。然而基因的功能活性主要靠蛋白质来实现，随着蛋白质组分析技术的出现及在肺癌研究中的应用，一些肿瘤标志物也逐渐被识别鉴定出来并应用于临床诊断。资料显示，国际上肺癌总体5年生存率仅为10％-15％，近年来基因组和蛋白质组的研究提高了对肺癌患者的管理水平，新的治疗理念、手术方式、化疗药物不断涌现，靶向治疗等也层出不穷，但肺癌患者5年生存率仅从13％提高到16％，并没有较大幅度的改观，且复发率高，即使是早期肺癌也存在高死亡率和易复发现象。目前，对调控肿瘤的生物学行为掌握的有限性，仍然是导致肺癌患者预后不良的主要因素。因此，揭示这一疾病的生物学功能，寻找有效的生物学标记并探索新的治疗靶点仍然是当务之急。　　 DEK基因定位于6p22.3染色体，首次发现是在t(6;9)(p23; q34)易位的急性髓细胞性白血病(AML)一亚型中以DEK-CAN融合蛋白的形式被分离出来，其中CAN蛋白是一种核孔蛋白，并以病人姓名开头的大写字母DK为基础命名。因具有结合核酸的能力，导致DEK与多种细胞过程相关，包括DNA复制、损伤修复、基因转录的调控、mRNA的转录后加工等。尤其是，DEK在染色质组装及维持基因组稳定性方面发挥重要作用。　　 已证实在乳腺癌、视网膜母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤等多种肿瘤中均出现DEK过表达现象，这些研究提示DEK与肿瘤的发生发展密切相关。Privette Vinnedge等在乳腺癌的研究中表明DEK能促进乳腺癌细胞增殖及侵袭;Wise-Draper等的研究中也指出DEK具有促癌作用，包括抑制细胞分化、衰老以及协助癌基因转化，并与恶性细胞抗凋亡相关。这些研究提示DEK在肿瘤细胞中具有多种功能，是一种极其重要的癌基因。　　 但是DEK在非小细胞肺癌中的表达情况及其与临床病理因素的关系还不清楚，其对肺癌细胞生物学行为的影响尚未见文献报道。　　 本研究拟定通过两部分探讨DEK在非小细胞肺癌中的表达及功能研究。首先，检测DEK在非小细胞肺癌中的表达及意义，以及其与非小细胞肺癌患者预后的关系;其次，探讨DEK对肺癌细胞增殖及迁移能力的影响，揭示DEK通过调控Rho/ROCK/MLC信号途径来影响肺癌细胞的迁移能力。　　 材料与方法　　 一、 NSCLC病人及组织样品　　 179例原发性非小细胞肺癌标本及38例相应正常肺组织标本来自中国医科大学附属第一医院病理科存档蜡块，其中67例有随访结果的非小细胞肺癌标本源于1998年至2002年中国医科大学附属第一医院，生存时间的计算为从手术日期开始到由于复发/转移而死亡的日期或随访截止日期为止。所有病人术前未接受任何化学或放射治疗。常规病理检查手术切除的肺门、纵膈以及肺内淋巴结，用于确定肺癌的淋巴结转移情况。患者的临床病理资料包括年龄、性别、组织学类型、淋巴结转移、病理分期，摘自患者的病历资料。179例非小细胞肺癌包括:男性117例，女性62例，年龄36～76岁，平均年龄61岁。按2004年WHO肺肿瘤组织学分类标准:鳞癌84例，腺癌95例;高分化59例，中、低分化120例，有淋巴结转移106例，无淋巴结转移73例。依据国际抗癌联盟(UICC)修订的肺癌TNM分期标准:Ⅰ期80例，Ⅱ-Ⅲ期99例。　　 二、免疫组织化学染色　　 免疫组化检测试剂盒和浓缩型DAB试剂盒为福建迈新生物工程有限公司产品，DEK多克隆抗体为ProteinTech Group中国分公司—武汉三鹰生物技术有限公司产品。操作步骤简略为:将石蜡组织块切成4μm厚的切片，脱蜡，脱水，在柠檬酸盐抗原修复液中修复后，按SP法操作步骤进行，一抗用抗DEK的多克隆抗体(1∶200)4℃孵育过夜，生物素标记的二抗37℃孵育30分钟，DAB显色，苏木素染色。为证明DEK蛋白抗体免疫组化检测的特异性，实验中用已知阳性的乳腺癌切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。　　 三、细胞系和细胞培养　　 冻存于液氮的A549、H1299、LK2、LTE-a-2(LTE)、SPC-A-1(SPC)、H157、LH7和BE1经复苏后，用DMEM(含有10％新生牛血清)或1640培养液（含有10％新生牛血清，100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素），在37℃，5％ CO2饱和湿度条件下培养，经3次传代稳定后，进行转染。　　 四、细胞瞬时转染和转染效率及浓度测定　　 转染前24小时将细胞按50％密度接种于6孔板，采用LipofectamineTM2000（Invitrogen, USA）转染试剂按照说明书进行转染，8-12h FCM监测转染效率，48h后终止细胞培养，用于后续实验。Real-time PCR和Western blot检测干扰效率。　　 五、Real-time RT-PCR　　 利用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)合成特异性的cDNA，反应体系15ul（总RNA10ul），在基因扩增仪（G-Storm，英国）内经如下循环完成反转录过程:16℃，30min;42℃，30min;85℃;5min，4℃贮存，次日扩增待用，或-20℃贮存，30天内待用。Real time PCR在Applied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，USA)内完成。反应体系20ul，包括cDNA1.33ul，按照TaqMan MicroRNA Assays Kit(Applied Biosystems)优化程序进行扩增，采用相对定量的方法，循环过程如下:一次循环:95℃，10 min;45个循环:95℃，15 sec;60℃，1.0 min。实验组及对照组均设2次重复。用3次独立样本经过3次独立实验后得到的数据用公式RQ=2-△△Ct的方法进行分析。　　 六、Western blot检测　　 收集细胞或剪碎的新鲜肺癌组织加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，15000转/min，15min)，提取上清为总蛋白。根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS—聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量50μg，常规电泳、转膜、封闭，一抗4℃孵育过夜，相应HRP-羊抗鼠/兔IgG二抗室温孵育2h，GAPDH作为内对照。WesternLightning(R)-ECL, Enhanced Chemiluminescence Substrate(Perkin Elmer,NEL100001EA)检测，显影。UVP图像处理系统采集图像，ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度。分别计算不同指标和GAPDH的INT×S，用二者的比值显示不同指标的表达水平。　　 七、细胞增殖检测及集落形成实验　　 将单个细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔体积100ul含3.5×103个细胞，培养24hr，每孔加入MTT（3-[4，5-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide）溶液（5mg/ml，Sigma，St.Louis.MO）继续培养4hr，吸去上清液，加入150ul DMSO（Sigma，USA），振荡10min，490nm波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照，绘制细胞生长曲线。对于集落形成实验，在干扰48小时后接种1000个细胞于6cm培养皿中，当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用苏木素染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。　　 八、流式细胞术检测细胞凋亡　　 收集细胞，用胰酶消化，轻轻吹打;离心1000r/5’弃培养基;加入1ml PBS用手弹匀，使细胞重悬移入1.5ml EP管中;用PBS洗两次，滤纸洗净PBS;加入1×buffer缓冲液250ul使细胞悬浮;按AnnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒(BDPharmingen，USA）说明书加入Annexin-Ⅴ5ul轻轻混匀，静置10min;加入190ulbuffer重悬细胞;再加入10ul PI，轻轻混匀，静置10min（避光室温下）;加入300ul1×buffer缓冲液;上机检测。　　 九、Transwell细胞迁移实验　　 Transwell小室上、下室之间滤膜孔径为8um，细胞转染24h后，以0.25％胰蛋白酶消化收集。Transwell小室的上室加入100ul用无血清培养基制成的4×104个单细胞悬液，下室加入600ul含10％血清的DMEM培养液或1640培养液，每组设6个复孔。37℃、5％C02培养箱培养;不同细胞系按不同时间终止培养后，PBS洗涤2次，以棉签小心拭除滤膜上室面的细胞，室温下风干Transwell小室，100％甲醇固定，苏木素染色。将培养小室倒置，在光学显微镜（Leica，德国）下观察、拍照，并计数每高倍视野滤膜底面的平均细胞数。每种细胞进行三次平行实验。　　 十、Rho-GTP pull-down试验　　 按照RhoA/Rac1/Cdc42 Activation Assay Combo试剂盒说明书(STA-405，Cell Biolabs，Inc.USA)操作。细胞长到将近80％～90％的融合度时弃去培养基，预冷的PBS洗两遍，然后加预冷的裂解液（0.5-1mL/100mm的培养皿）处理。接下来将培养皿置于冰上10-20min，4℃离心(14000 g/10 min)，然后将20μL0.5M EDTA加入等分的样品中。阳性对照和阴性对照中分别加入10μL的100XGTPγS和10μL的100X GDP。所有的小管均30℃振荡孵育30 min。65μL1.0 M MgC12终止反应。Rhotekin RBD或PAK PBD琼脂糖小球加到细胞裂解物中4℃孵育1h，14000 g离心10 Sec后，用裂解缓冲液洗脱小球，Rho-GTP被Laemmli样品缓冲液洗脱下来。最后Westem blot分析GTP结合的RhoA的量。　　 十一、统计学分析　　 所有统计数据均应用SPSS16.0进行分析。对DEK表达和临床病理因素的关系采用Chi-square检验，并应用Sepearman相关性检验分析DEK表达与非小细胞肺癌患者性别、年龄、组织学分型、分化程度、淋巴结转移、病理分期的相关性;生存分析采用Kaplan-Meier法，log-rank检验判断差异性;多因素COX模型分析非小细胞肺癌的独立性影响因素;其他数据分析采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。　　 实验结果　　 一、DEK在非小细胞肺癌组织中过表达　　 我们采用免疫组化的方法检测了DEK蛋白在179例非小细胞肺癌组织及38例癌旁正常肺组织中的表达情况。结果显示，在正常的肺组织中DEK的表达为阴性，38例正常支气管上皮DEK表达均为阴性。在179例非小细胞肺癌中，DEK的阳性表达率为65.9％(118/179)，肺鳞状细胞癌DEK的阳性表达率为61.9％(52/84)，肺腺癌中DEK阳性表达率为69.5％(66/95)，阳性信号主要出现于肿瘤细胞细胞核中。与正常组织相比，DEK蛋白在肺癌组织中表达率明显增高，而且染色强度明显增强，具有统计学差异(P＜0.05)。　　 二、DEK在非小细胞肺癌组织中表达的意义　　 采用Chi-square检验及sepearman相关性检验分析了DEK表达与179例NSCLCs发病年龄、性别、组织学类型、淋巴结转移、病理分期及分化程度的相关性。结果显示:DEK高表达与分化程度呈负相关(r=-0.173，p=0.021);与pTNM(r=0.160，p=0.033)和淋巴结转移(r=0.195，p=0.009)呈正相关。DEK表达高低与NSCLCs患者性别、年龄、组织学类型等均无相关性。　　 三、DEK的表达与67例NSCLCs患者预后关系　　 为了进一步研究DEK与NSCLCs预后关系，我们检测了有随访结果的67例NSCLCs组织DEK表达情况。单因素分析性别、年龄、组织学分型、分化程度、淋巴结转移、病理分期、DEK表达与NSCLCs患者预后的关系结果发现:低分化的NSCLCs患者生存时间低于高分化的NSCLCs患者(p=0.016)，有淋巴结转移的NSCLCs患者生存时间显著低于无淋巴结转移的NSCLCs患者(p=0.000)，病理分期为Ⅰ期的NSCLCs患者生存时间明显高于Ⅱ～Ⅲ期的NSCLCs患者(p=0.000)以及DEK高表达的NSCLCs患者生存时间低于DEK低表达的NSCLCs患者(p=0.021)。而性别、年龄、组织学分型与NSCLCs患者预后没有明显关系。　　 将单因素分析中对NSCLCs患者预后有影响的四个因素进行多因素COX模型分析。采用Backward:Wald方法分析的结果显示:淋巴结转移和病理分期是影响NSCLCs患者预后的独立因素，而DEK表达高低和分化程度不是影响NSCLCs患者预后的独立因素。　　 四、DEK在非小细胞肺癌细胞系中的表达　　 为了探讨DEK对肺癌细胞生物学行为的影响，我们检测了8种非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、LTE、SPC、LK2、H157、LH7和BE1中DEK的表达情况，从中选取了DEK相对中等表达水平的A549和H1299两种细胞系作为进一步研究的细胞系。　　 五、干扰DEK可抑制肺癌细胞增殖　　 在A549和H1299细胞系中我们采用DEK SiRNA干扰DEK的表达。转染48小时后，与转染乱序siRNA的细胞相比，转染DEK SiRNA的细胞中DEK的表达水平明显下降（其中A549干扰效率71.8％;H1299干扰效率76.5％）。MTT法测定结果显示，转染DEK SiRNA的A549和H1299细胞增殖能力明显低于对照组(P＜0.05)。与MTT试验结果一致，干扰DEK后，A549和H1299细胞的集落形成数目明显减少，对照组比实验组:A549（266±22 vs148±15，p＜0.05）;H1299（357±35 vs167±23，p＜0.05）。此外，我们检测了在A549和H1299细胞系中干扰DEK后对细胞周期蛋白cyclin A，cyclin B及cyclin D1表达的影响。结果显示，与对照组相比，干扰DEK后cyclin A的表达水平显著下调，而cyclin B及cyclinD1表达水平无明显变化。　　 六、DEK通过RhoA调控肺癌细胞的迁移　　 我们采用Transwell试验探讨DEK对肺癌细胞迁移能力的影响。结果显示，与对照组相比，干扰DEK后肺癌细胞的迁移率下降，细胞迁移能力下降，p＜0.05，有统计学差异性。为了进一步研究DEK调控肺癌细胞的迁移机制，干扰DEK前后我们分别检测了迁移相关蛋白RhoA，RhoB和RhoC的表达水平。结果显示，在A549和H1299细胞系中干扰DEK后RhoA的RNA和蛋白表达水平均显著下调，而RhoB和RhoC的RNA或蛋白表达水平在转染前后无明显变化。接下来，我们在A549和H1299两种细胞系中共转染了p CMV6-DEK质粒和RhoA SiRNA，然后Transwell试验检测肺癌细胞迁移能力变化，结果显示，与对照组相比，上调DEK后肺癌细胞的迁移率增多，细胞迁移能力增强(P＜0.05)，而共转染pCMV6-DEK质粒和RhoA SiRNA后，肺癌细胞的迁移率没有明显变化(P＞0.05)。　　 七、干扰DEK使RhoA信号途径失活　　 为了进一步探讨干扰DEK后是否影响了Rho GTPases的GTP/GDP结合状态，我们采用Rho-GTP pull-down试验检测GTP结合的RhoA。结果显示，在A549和H1299细胞系中干扰DEK后GTP-RhoA的表达水平明显下调(p＜0.05)。因此， DEK下调影响了活化的GTP-RhoA水平。接下来，我们假设干扰DEK后RhoA信号途径失活。应用Western blot技术我们检测了RhoA信号途径的成员，包括下游效应分子ROCK1及MLC2(myosin light chain2)的表达水平。结果显示，与未处理组相比，在DEK SiRNA处理的A549和H1299细胞系中，伴随着活化的GTP-RhoA表达水平的下调，p-MLC2的表达水平也明显下调(p＜0.05)，而总的ROCK1及总的MLC2蛋白表达水平在DEKSiRNA处理前后没有明显变化(p＞0.05)。　　 八、干扰DEK对肺癌细胞凋亡的影响　　 在A549和H1299细胞系中干扰DEK后我们采用AnnexinⅤ试剂盒检测其对细胞凋亡的影响，结果显示，干扰DEK前后对细胞凋亡并没有显著影响(A549:p=0.111; H1299: p=0.157)。　　 结论：　　 1、DEK在非小细胞肺癌组织中过表达，并且其过表达与淋巴结转移和病理分期呈正相关，与分化程度和患者预后生存率呈负相关。　　 2、DEK下调能够抑制肺癌细胞的增殖，可能与下调CyclinA的表达有关;但其对细胞凋亡没有明显影响。　　 3、DEK下调通过抑制RhoA/ROCK1/MLC2信号途径来抑制肺癌细胞的迁移。