本文较系统地研究了粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)不同菌株的生物学特性和类枯草杆菌蛋白酶酶活;筛选出具优良生物学性状的类枯草杆菌蛋白酶高产菌株;确定了高产菌株最佳发酵培养条件;并对其产 Pr1 蛋白酶进行了进一步分离、纯化;同时也克隆出该菌株的类枯草杆菌蛋白酶基因;从而为改造昆虫病原真菌奠定了基础。 通过预备实验和参考各种文献资料,以下述培养条件诱导 Pr1 蛋白酶的产生:先将粉拟青霉菌株接种在 SDY 培养基上,25℃,170rpm 振荡培养 4d。菌丝生长接近最大量时,离心,将洗净的菌丝体(沉淀)接种到添加了几丁质的诱导培养基中,初始pH 值为 8.0,22℃、170rpm 振荡培养 12h。通过对来自不同地域和寄主的 24 株粉拟青霉进行了类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)活力的测定,结果表明 Pf102 与 Pf96 菌株相比其他研究的菌株其酶活力高,A405值分别为 0.2028 和 0.1749。 选取产 Pr1 蛋白酶活力相对较高的 15 株粉拟青霉菌株为实验材料,比较了它们的生物学特性,分析了它们在产孢量、生长速度、抗旱能力、抗紫外能力等方面的差异。结果表明,粉拟青霉菌落生长和产生孢子的最适温度为 20℃。在此温度下,24h孢子萌发率在 80%~100%之间;此外不同菌株的抗旱力差异较大,Pf01 抗旱能力最强,而 Pf127 的抗旱能力最弱。经紫外线照射 5min,菌株的萌发率在 44%~81%范围内。Pf96 的生长速度,产孢量,萌发率和抗紫外线能力均为最高或次高。 通过对供试菌株产蛋白酶及生物学特性方面的研究比较,最终确定了 Pf96 菌株作为筛选最佳发酵培养条件,进一步分离、纯化 Pr1 蛋白酶以及克隆其类枯草杆菌蛋白酶基因的研究对象。 不同接种量对 Pf96 菌株产 Pr1 蛋白酶活力影响的试验结果表明:接种量的大小对 Pf96 菌株产 Pr1 蛋白酶的相对活力影响不大,但相对来讲 10%的接种量对产 Pr1蛋白酶更为有利。根据对 Pf96 菌株 Pr1 蛋白酶产酶曲线的研究得知:虽然在诱导后12h 有一个产酶高峰,但在 60h 时又出现另一产酶高峰,根据各种参考文献综合报道,一般虫生真菌在加入诱导物 12h 后,便达到了产酶高峰。在以后的发酵条件研究过程中,采用诱导 12h 后的发酵液作为原始的粗酶液,测定其酶活。 在相同培养条件下,以酶的相对活力为指标,通过单因素诱导物、温度、pH 值、菌龄,培养基不同组分配比的正交试验,结果表明:粉拟青霉菌株 Pf96 的最适培养条件为:添加 1%蝉蜕的基本盐培养基、培养温度 25℃、pH8.0 和接种菌龄 6d。 在蛋白酶纯化过程中,首先向粗酶液中添加硫酸铵粉末分别至不同饱和度,试验结果表明:在 80%硫酸铵饱和度时,虽然回收率达到 41.9%(不是最高),但其纯化倍数最高达 2.6;因而选择 80%的硫酸铵饱和度为试验标准。