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核因子相关因子-2(NF-E2-related Factor2, Nrf2)介导肝细胞保护性蛋白表达,是肝脏抗氧化应激系统的中心环节。Nrf2抵抗持续性肝损伤,如药物或酒精滥用、肝炎病毒感染、自身免疫损害等所致连续的损伤修复反应及启动氧化应激,胞浆内Nrf2与Kelch样EcH相关蛋白1(Kelch-likeECH-associatedprotein-1, Keap1)解藕联转移至胞核内,结合到抗氧化反应元件(Anti-oxidant response element, ARE)启动子区域转录性调节保护性基因,如NADPH醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductasel, Nqo1]表达,发挥抗氧化应激、抵抗外源性物质引起的肝损害、减轻肝脏炎症和纤维化病变等作用。扶正化瘀胶囊主要组成部分为丹参、桃仁、松花粉、绞股蓝、发酵虫草菌粉、五味子,通过改善氧化应激病理微环境、利于肝脏血循环压力缓解、拮抗肝星状细胞活化增殖及分泌功能亢进实现其抗肝纤维化作用。Nrf2与扶正化瘀胶囊都有明确的肝保护作用,将二者结合研究进一步探讨扶正化瘀胶囊抗肝纤维化的分子学机制。目的1.本实验采用CCL4腹腔注射制备肝纤维化(Hepatic fibrosis)模型,并通过组织病理学检测证实肝脏炎症及纤维化病变程度；2.观察肝纤维化小鼠Nrf2、 Nqo1、α-平滑肌肌动蛋白(a-Smooth muscle actin, a-SMA)、纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)的表达情况；3.观察进行扶正化瘀胶囊对肝纤维化小鼠干预后肝脏组织病理学改变；4.观察扶正化瘀胶囊干预后对照小鼠及肝纤维化小鼠Nrf2、Nqo1、α-SMA、FN表达变化的情况,探讨扶正化瘀胶囊抗肝纤维化的分子学机制。方法70只雌性健康昆明小鼠,清洁级,随机分为对照组24只,包括正常组A1(n=8)：空白对照；矿物油组A2(n=8)：腹腔注射同体积矿物油,排除矿物油对肝纤维化模型建立的干扰；FZHc组A3(n=8)：第7周开始给予扶正化瘀方(扶正化瘀胶囊药粉由ddH2O配制成浓度为0.1g/ml药液)灌胃2mg/g.d,明确扶正化瘀方无肝损害副作用。模型组46只,腹腔注射石蜡油稀释的CCL4(体积比1：10)0.25mg/g,每3日一次,共10周,包括模型6周组B1(n=10)：造模6周处死,用以观察成模情况,指导进行扶正化瘀方干预治疗；模型10周组B2(n=12)：第10周末处死,作为同期对照；造模第7周,L-FZHc组C1(n=12)：扶正化瘀方灌胃1mg/g.d; H-FZHc组C2(n=12)：扶正化瘀方灌胃2mg/g.d,用以观察不同剂量的扶正化瘀方影响效果,连续4周。第6、10周末分批处死小鼠,收集肝脏标本做以下检测：1.肝脏石蜡切片HE染色观察组织炎症程度变化,Masson胶原染色观察纤维化病变；2.免疫组化染色检钡Nrf2、 Nqo1、、-SMA、 FN的表达情况；3.VVestern blot检测细胞内Nrf2、Nqo1总蛋白表达量及Nrf2核转移情况；4RT-PCR检测Nrf2的mRNA表达情况。结果1.本实验用CCL4腹腔注射法成功建立小鼠肝纤维化模型,组织病理学检测显示模型6周组具有明显炎性坏死灶及肝纤维化形成,并且随CCL4损伤时间延长,模型10周组B2肝脏炎症、肝纤维化程度均明显增加(P<0.05)；2.免疫组化染色结果显示模型6周组可见明显Nrf2、 Nqo1、 α-SMA、FN阳性表达,随CCL4损伤时间延长,模型10周组B2的Nrf2、 Nqo1、 α-SMA、FN阳性表达均明显增多(P<0.05);3.、western blot与RT-PCR检测结果均显示于10周末矿物油组A2、FZHc组A3分别与正常组A1的Nrf2、Nqo1总蛋白及Nrf2mRNA、核转移量相比无统计学差异,而模型10周组B2小鼠Nrf2、Nqo1总蛋白及Nrf2mRNA、核转移均明显增多(P<0.05)；4.与模型10周组B2相比,扶正化瘀胶囊灌胃后,组织病理学显示L-FZHc组C1、H-FZHc组C2小鼠肝脏炎症反应明显减轻并呈剂量依赖性(P<0.05)、肝纤维化病变程度明显减轻(P<0.05);免疫组化染色结果显示a-SMA、FN蛋白表达则明显的减少(P<0.05),均呈剂量依赖性(P<0.05)；5.Western blot与免疫组化染色检测结果均显示,与模型10周组B2相比,扶正化瘀胶囊灌胃后,L-FZHc组C1、H-FZHc组C2的Nrf2、 Nqo1,总蛋白表达显著增多,呈剂量依赖性(P<0.05)；western blot还进一步证实扶正化瘀胶囊促进Nrf2核转移均明显增多(P<0.05),并具有剂量依赖性(P<0.05)；6.RT-PCR检测结果显示,模型10周组B2与模型6周组B1相比无统计学差异；而扶正化瘀胶囊促进Nrf2mRNA的相对表达增多,L-FZHc组C1、H-FZHc组C2较模型10周组B2相比显著增多,差异有统计学意义(P<0.05),并具有剂量依赖性(P<0.05)。结论小鼠肝脏经CCL4腹腔注射6周即出现典型的肝纤维化病理改变,随着CCL4肝损伤时间延长,肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化标志α-SMA、细胞外基质FN表达明显增多,肝脏炎症反应及纤维化改变明显加重。应用扶正化瘀胶囊灌胃4周后,Nrf2表达、Nrf2胞核内转移明显增多,促进其下游靶基因Nqo1的表达显著增多,并抑制HSCs活化及FN沉积,提示扶正化瘀胶囊肝保护作用机制之一可能是通过促进Nrf2、肝内细胞抗氧化酶和II相解毒酶Nqo1表达,从而降低了肝脏炎症损伤及纤维化病变程度,起到肝脏保护作用。