一、研究背景及目的原发性肝癌(以下简称肝癌)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,每年大约有100万新发肝癌病例,其中45%在我国大陆,我国是世界上肝癌高发区之一。近年来,肿瘤分子生物学的进展使肝癌的发病机制和自然病程得到进一步阐明;医学影像技术和实验室诊断技术的突飞猛进使肝癌的临床诊断水平也取得了长足的进步;相比之下,肝癌的治疗却进展缓慢。不断涌现的各种新的肿瘤治疗方法对肝癌预后的改善几乎是微乎其微,疗效远非理想的各种常规治疗方法在肝癌的治疗中仍占据绝对主导地位。在各种实体瘤中,肝癌仍为预后最差者之一。肝癌的治疗迫切需要新的有效方法。 肿瘤基因治疗的研究始于上世纪80年代,90年代初进入临床试验。人们对肿瘤的基因治疗曾寄予厚望,但临床试验的结果表明:肿瘤的基因治疗虽然是安全的,但其抗肿瘤效能非常低。究其原因,主要是由于传统基因治疗的载体系统靶向肿瘤细胞的能力差以及抗癌基因的表达量低造成的。因此,提高载体系统靶向肿瘤细胞的能力和抗癌基因的表达量成为肿瘤基因治疗的关键。肿瘤增殖病毒具有在肿瘤细胞中特异性地增殖并杀灭肿瘤细胞的特性。在感染肿瘤细胞后,肿瘤增殖病毒可以不断地复制并最终裂解细胞,释放出的子病毒又会感染和裂解周围的肿瘤细胞。从理论上讲,这种不断放大的病毒复制将持续到肿瘤细胞完全被杀灭为止。E1B 55kDa功能缺失的腺病毒ONYX-015(dl1520)是肿瘤增殖病毒的范例,在体外实验和动物实验中均获得了良好效果,但在作为单一因素治疗肿瘤的临床试验中其疗效却令人失望。这提示仅以增殖病毒治疗肿瘤其疗效是有限的。以增殖病毒为载体携带治疗基因的基因-病毒治疗将肿瘤增殖病毒治疗和肿瘤基因治疗有机结合起来,利用载体病毒在肿瘤细胞中选择性增殖的特性实现抗癌基因在肿瘤细胞中的高效表达,以弥补肿瘤增殖病毒的不足。肿瘤增殖病毒对肿瘤细胞的杀灭作用和治疗基因的抗癌作用相互协同,进一步提高抗肿瘤效能。因此,基因-病毒治疗有望为肿瘤的治疗开辟一条新的途径,目前正成为一个新的研究热点。对现有的病毒加以改造以获得能特异性杀灭肿瘤细胞的载体病毒和选择高<WP=7>效的抗癌基因是基因-病毒治疗的两个关键。通过敲除病毒在正常细胞中复制所必需但在肿瘤细胞中复制非必需的基因而产生的缺失突变型病毒,可以获得在肿瘤细胞中特异性增殖并杀灭肿瘤细胞的能力;利用肿瘤或组织特异性启动子来控制病毒基因组复制过程中必需基因的表达是基因重组技术对现有的病毒加以改造获得肿瘤增殖病毒的又一有效策略。p53基因突变和端粒酶阳性是常见的肿瘤生物学行为,在肿瘤的发生机制中起着重要作用。E1B 55kDa基因为腺病毒在正常细胞中复制所必需,但在p53基因突变的肿瘤细胞中则并非必需。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶活性的主要亚单位,hTERT启动子只有在端粒酶阳性的细胞中才具有转录活性。抗肿瘤新生血管生成是肿瘤治疗的有效策略之一,目前已经有数十种新生血管抑制剂进入临床试验本研究。内皮抑素(Endostatin)是目前已知的最强的肿瘤血管抑制因子。因此,本研究采用腺病毒E1B 55kDa基因缺失并携带小鼠内皮抑素(mouse Endostatin 简称mE)构建基因-病毒治疗系统CNHK200-mE,采用hTERT启动子控制腺病毒E1A表达并携带mE构建基因-病毒治疗系统CNHK300-mE,并通过体外和动物实验观察这两种基因-病毒治疗系统对肝癌的治疗作用。二、方法1.基因—病毒治疗系统CNHK200-mE和CNHK300-mE的构建和制备利用基因重组技术构建E1B 55kDa缺失并携带mE基因的载体质粒pXC-delE1B-mE和hTERT启动子控制腺病毒E1A表达并携带mE 基因的载体质粒pXC20-mE;将上述质粒分别与含有腺病毒右臂的质粒pBGH10共转染至293细胞,通过细胞内DNA同源重组获得新的重组病毒,PCR法对重组腺病毒DNA进行鉴定,重组正确的腺病毒分别命名为CNHK200-mE和CNHK300-mE。病毒在293细胞中反复扩增到需要量,氯化铯梯度离心法纯化后冻存备用。2.体外实验1) 病毒增殖实验:用CNHK200-mE分别感染两株肝癌细胞Hep3B和HepGII及正常的肝细胞株L02,用CNHK300-mE分别感染Hep3B和HepGII和成纤维细胞MRC-5,50%组织培养感染剂量(TCID)法测定病毒滴度并计算出在各种细胞中的增殖倍数; <WP=8>2) 病毒杀伤实验:用四氮唑盐比色试验(MTT)法检测CNHK200-mE和CNHK300-mE对HepGII、Hep3B以及MRC-5 三种不同细胞的杀伤效率,并分别与wAd5、 Ad-mE、ONYX-015相比较;E1A、E1B和治疗基因mE表达的检测及定量分析:Western-Blot法检测CNHK200-mE对HepGII、Hep3B和L02以及CNHK300-mE对HepG2、Hep3B和MRC-5感染后病毒蛋白E1A、E1B及治疗基因mE的表达;ELISA定量检测治疗基因mE的表达。3.动物实验建立肝癌SMMC-7721细胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,设CNHK200-mE、CNHK300-mE、Ad-mE、 ONYX-015和病毒稀释液空白对照组,观察CNHK200-mE和CNHK300-mE对肝癌生长的抑制作用;ELISA分析检测裸鼠血清中mE的表达量;取肿瘤标本,常规HE染色观察肿瘤的生长情况;vWF因子(von Willebrand factor)免疫组化染色观察肿瘤内血管生成情况;腺病毒外壳蛋白六邻体(hexon)免疫组化染色和透射电镜观察病毒在移植瘤中的增殖情况。三、结果所