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多发性骨髓瘤（MM）为浆细胞恶性增殖性疾病，其特征是浆细胞合成分泌单克隆的独特型Id（idiotype）。迄今，应用常规化疗（马法兰，强的松等）患者中位生存期仍然徘徊在3年左右。大剂量化疗结合自体造血干细胞移植可延长中位生存期，但仍非治愈性。同种异体骨髓移植（BMT）在部分病例中归因于免疫性GVM效应，可达到满意效果。 资料表明，MM患者可产生针对Id的T淋巴细胞反应和相应抗抗体生成，体外试验和动物模型证实，基于Id的免疫治疗可致浆细胞瘤消退。树突状细胞（dendritic cells，DC）是体内功能最强抗原提呈细胞，可诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）生成。在MM患者单核来源DC（MDDC）有正常活性和功能。负载Id后免疫治疗，部分患者出现显著免疫反应，考虑到MM患者经过传统治疗易达微小残存疾病状态（MRD），使用DC及CTL免疫治疗有助延长生存期，并延迟复发。 细胞杀伤抑制受体（killer inhibition receptor，KIR）主要表达于自然杀伤细胞（NK），也表达于部分T细胞。一般认为，TCR介导T细胞活化和增殖，而KIR分子介导免疫抑制性反应。迄今，未见MM患者CTL与KIR表达相关研究报道。 目的 本研究通过DC呈递自体抗原途径体外诱导MM患者CTL，并探讨其免疫生物学特征，为临床过继免疫治疗MM打下基础。研究内容分为四个部分：（一）MM患者外周血DC的分离、培养和鉴定；（二）MM患者外周血CTL的诱导（in vitro）；（三）MM患者CTL细胞KIR表达研究；（四）MM患者CTL体内免疫效能观察（in vivo）。 方法与结果 第一部分：用塑料贴壁的PBMNCs来源或者免疫磁珠阴性选择分离途径，建立体外培养技术，从MM患者外周血中获取DCs。在含GM-CSF和IL-4的无血清培养基（AIM-V）中，37℃，5％CO2培养箱中培养5～7天，可获得具有典型树突状细胞形态学特征的细胞。两种分离途径得率统计学比较无差异（n=5）。同种混合淋巴细胞反应及自体抗原呈递试 第一军医大学博土学位论文验证实，MM患者外周血来源DC具有很强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力及呈递自体抗原的能力。外周血来源DC培养5～7天后，流式细胞仪分析表明，部分细胞表达成熟DC特征性标记CDI。，部分表达共刺激分子 CD80及 CD86，高表达 HLA－DR分子，几乎不表达单核细胞特异性标记 CD14。rhIL－3或／及rhSCF加入培养体系并不增加 MM患者外周血DC得率。兔疫表型也无明显改变。提示DC来源于PBMNCS中单核细胞，而非CD34”造血祖细胞，本研究为获取DC进行深入研究及临床免疫治疗奠定实验基础。 第二部分：从MM患者外周血或尿液中，以盐析、层析等生化方法提取纯化自体Id蛋白(包括IgG，IgA及人人SDS－PAGE电泳鉴定为单－条带纯，免疫磁珠阴性选择法分离患者外周血T淋巴细胞，建立体外CTL诱导体系。在CTL诱导过程中最适的自体抗原负载浓度为 10ug／ml，只有在DC纯化后，加入自体抗原，T淋巴细胞达到最大程度增殖。利用有限稀释方法，从5例MM患者外周血中，有3例可体外诱导出Id特异性 CTL克隆。例 2（初治患者，血清 IgG75．4g／L）及例 5（尿人轻链疾病）未能诱导出。并分析各自CTL前体频率相应为1％，5％和7％。三例MM患者CTL细胞免疫表型分析表明，为非均一性细胞群体，以CDS”CTL为主，包括少量CD4”及部分CDS”CD28”、CD3－CD56”CD16”及Y6“CTL等亚群。本研究建立了通过DC呈递自体抗原诱导CTL细胞生成的体外无血清培养体系，该途径可望为MM患者过继免疫治疗提供崭新的手段。 第三部分：测定了3例MM患者T细胞及CTL细胞KIR分子表达率。结果显示KIR表达有多型性特点，在体外抗原激活后CTL以表达P58．2分子为显著特征．利用单抗荧光标记抗体结合有限稀释方法，体外p分选培养出MR”CTL及mR”CTL两型细胞。体外杀伤试验（E：T为 10：l）证实，两型细胞对Daudi细胞均有一定杀伤活性，而以抗KIR抗体阻断KIR 分子表达后，KIR”CTL杀伤活性提高。KIR”CTL几乎不杀伤RPMI8226细胞，但阻断相应以R分子或靶细胞MHC－I分子后，杀伤活性得到一定程度恢复。两型细胞均可体外杀伤负载自体抗原的DC细胞，阻断DC表面MHC．I分子后，杀伤活性下降。证实诱导的CTL为抗原特异性。Elispot试验结果表明，KIR－CTL以分泌r二FN为主，参与Thl ．4． 第一军医大学博士学位论文 反应，而mR“CTL主要分泌L－4，可能介导 ThZ反应。利用 RT－PCR 方法从三例MM患者KIR”CTL细胞中都可以扩增出300hp大小的 P58二CDNA特征性条带。条带荧光强度与KIR分子表达率相一致。电镜 观察和 AO／EB染色可观察到 KIR”CTL凋亡细胞的显著形态学特征， DNA电泳有典型的“ Ladder”梯形条带，A。exin－Vo1双染证头mR” CTL早期凋亡事