【摘 要】
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生物胺普遍存在于黄酒等发酵食品中,适量的生物胺对人体有积极作用,但摄入高含量的生物胺会诱发人体产生头疼、恶心等一系列不良反应。研究发现放线菌,特别是糖多孢菌,为黄酒酿造过程中的优势微生物之一,且在生物胺降解方面具有一定的潜力,但目前关于糖多孢菌降解生物胺的相关研究处于空白阶段。因此,本论文从黄酒发酵过程中筛选获得可降解生物胺的糖多孢菌,并通过异源表达其中的胺氧化酶研究了纯酶的酶学性质及对生物胺的降
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生物胺普遍存在于黄酒等发酵食品中,适量的生物胺对人体有积极作用,但摄入高含量的生物胺会诱发人体产生头疼、恶心等一系列不良反应。研究发现放线菌,特别是糖多孢菌,为黄酒酿造过程中的优势微生物之一,且在生物胺降解方面具有一定的潜力,但目前关于糖多孢菌降解生物胺的相关研究处于空白阶段。因此,本论文从黄酒发酵过程中筛选获得可降解生物胺的糖多孢菌,并通过异源表达其中的胺氧化酶研究了纯酶的酶学性质及对生物胺的降解能力,为利用糖多孢菌及其酶制剂控制黄酒等发酵食品的生物胺含量提供一定的理论基础。主要研究结论如下:1.黄酒发酵过程中降解生物胺糖多孢菌的筛选。从不同来源的黄酒麦曲与发酵醪中共筛选获得4种,37株糖多孢菌。通过对糖多孢菌菌株的生物胺代谢能力分析,共筛得6株具有较强生物胺降解能力且产胺能力极弱的菌株,在生物胺培养基体系中,6株菌株的总生物降解率均大于50%。2.降胺糖多孢菌在黄酒发酵过程中降生物胺能力的评价。将糖多孢菌以纯种麦曲的形式接入至黄酒发酵中,实验组黄酒发酵正常,各项理化指标均符合黄酒国家标准,相较于传统发酵黄酒,实验组黄酒的总生物胺含量降低了2.47%~10.58%。5%乙醇、2 g·L-1乳酸、2 g·L-1乙酸已对糖多孢菌的生长具有显著的抑制作用,因此本论文对2株不同菌种的具有较强生物胺降解能力的降胺糖多孢菌—披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsuta)F1902和霍氏糖多孢菌(Saccharopolyspora hordei)F2002的生物胺降解酶进行进一步研究,为降解黄酒等发酵食品中的生物胺提供新的途径。3.披发糖多孢菌胺氧化酶的异源表达与酶学性质研究。成功克隆了来源于S.hirsuta F1902的含铜胺氧化酶(Copper amine oxidases,Cu AOs)基因,并在大肠杆菌中进行表达,纯化后的重组酶Cu AOShir对苯乙胺、组胺和酪胺具有显著的氧化能力。诱导温度为25℃,IPTG浓度为0.2 mmol·L-1,诱导时间为16 h为最佳诱导条件。对纯酶酶学性质的研究表明,当底物分别为苯乙胺、组胺和酪胺时,Cu AOShir的最适反应p H分别为6.5、7.0和7.0,最适反应温度均为45℃;Km值分别为0.71、1.70和0.68 mmol·L-1;kcat/Km值分别为72.29、42.38和72.38 L·mmol-1·min-1。Cu AOShir对乙醇、乙酸、乳酸有一定的耐受能力,Cu AOShir对2种市售黄酒中的总生物胺降解率分别为30.25%和18.84%,对2种市售酱油中的总生物胺降解率分别为15.16%和18.26%。4.霍氏糖多孢菌胺氧化酶的异源表达与酶学性质研究。成功克隆了来源于S.hordei F2002的含铜胺氧化酶基因,并在大肠杆菌中进行表达,纯化后的重组酶Cu AOShod可降解苯乙胺、组胺和酪胺。对纯酶酶学性质研究表明,底物相同时,Cu AOShod和Cu AOShir的最适反应p H、温度相同;相比于Cu AOShir,Cu AOShod对三种生物胺的亲和力更强,但催化效率较低;Cu AOShod对2种市售黄酒中的总生物胺降解率分别为21.28%和12.23%,对2种市售酱油中的总生物胺降解率分别为10.12%和14.90%。综上所述,本论文首次从黄酒发酵过程中筛选获得具有降解生物胺功能的糖多孢菌,同时,从S.hirsuta F1902和S.hordei F2002中分离纯化获得了2个含铜胺氧化酶,其对苯乙胺、组胺和酪胺具有显著的氧化能力,对黄酒等发酵食品中的生物胺也具有一定的降解能力,为利用糖多孢菌控制黄酒等发酵食品中的生物胺含量提供了一定的理论基础。
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