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当归是我国传统草本植物,作为临床常用药而被广泛使用,其多糖为主要药理成分之一,现代药理学研究证明该多糖具有补血、抗肿瘤,抗辐射,免疫调节,抗氧化及治疗胃溃疡等作用。黄芪作为我国传统中药材已被使用超过2000年,在我国分布地域较广,其中黄芪多糖是最主要的有效成分,并表现出良好的免疫增强功能、抗肿瘤、抗流感、防衰老及抗辐射等作用。 归芪多糖(AAP)是依据古验方“当归补血汤”,将当归和黄芪以特定比例(1∶5)混合水煎提取出的多糖。归芪多糖在前期研究结果中虽呈现出广泛的药理活性,但一方面这些归芪多糖并未经过系统的分离纯化,含量较低、杂质较多,且理化性质和结构不明,不能为其药理机制的研究提供数据保障;另一方面,截止到目前为止,有关这方面的研究仍未见报道。 基于此,本研究以当归和黄芪为原料,优化归芪多糖的提取工艺与脱蛋白工艺,纯化粗归芪多糖并研究其理化性质、结构特征及抗氧化活性,为进一步开发利用归芪多糖奠定基础。 (1)以当归、黄芪为原料,优化酶辅助提取归芪多糖粗品的提取工艺。以多糖含量与提取率为评价指标,在单因素试验基础上,通过正交试验得出酶辅助提取归芪多糖粗品的最佳工艺。结果显示:纤维素酶辅助提取归芪多糖粗品的最优工艺条件为A1B3C3D3,即在酶底比为0.03%,酶解温度为55℃,酶解时间为180min,酶解 pH为5.5时,多糖含量和提取率最高,分别为63.02%和11.90%。 (2)以归芪多糖粗品为原料,研究最佳脱蛋白工艺,得到粗归芪多糖(AAP)。采用Sevag法、三氯乙酸法(TCA)、酶解法三种方法对归芪多糖粗品进行脱蛋白研究,比较其效果。结果表明,三种脱蛋白方法中,酶解法脱蛋白效果最佳。响应面法确定酶解法脱蛋白的最佳工艺参数为:酶反应温度为60℃,pH值6.0,酶量5000U/g时,蛋白去除率最高,可达80.4%,多糖损失率为最低,仅为6.4%。 (3)粗归芪多糖(AAP)经 DEAE-52纤维素柱色谱,Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱色谱纯化后,得到归芪多糖纯品 AAP-2A。通过物理、化学、光谱等方法对纯化后归芪多糖的理化性质和结构进行初步分析。结果显示:AAP-2A为中性多糖,其总糖含量为98.98%,相对分子量大于6.68×105 Dol,绝对分子质量为2.252×106 Dol,构象呈无规则线团状,多糖摩尔质量分布范围较集中,分子具有单分散性,即表明大小较均一。此多糖不含蛋白和核酸,在红外吸收光谱中呈现出明显的多糖特征吸收,AAP-2A由鼠李糖,半乳糖,阿拉伯糖,葡萄糖组成,其摩尔比为:1∶2.13∶3.22∶6.18,主链骨架由1,3-α-L-鼠李糖,1,3-β-D-半乳糖,1,3、1,5、1,3,5-α-L-阿拉伯糖和1,4、1,4,6-α-D-葡萄糖构成,侧链分支由1位连接的α-D-葡萄糖组成,侧链分支点位于阿拉伯糖的3位和葡萄糖的4位,说明 AAP-2A是一种新的中性杂多糖。 (4)从清除羟自由基(·OH)、DPPH自由基(·DPPH)和还原力的角度出发,研究并比较粗归芪多糖(AAP)与纯化后归芪多糖(AAP-2A)的抗氧化活性。结果表明:在一定浓度范围内,AAP与 AAP-2A的抗氧化活性均呈现剂量依赖关系,且 AAP-2A的活性强于 AAP。说明 AAP-2A具有较好的抗氧化潜力,暗示多糖的抗氧化活性可能与其纯度关系密切。