1.研究背景卵巢癌是目前全球死亡率最高的妇科恶性肿瘤。究其原因,是因为卵巢的解剖位置隐匿,早期卵巢癌常缺乏临床症状,而造成患者就诊时往往到了晚期,晚期病人的治疗过程中,常发生耐药和复发,5年生存率只有15-20%,与晚期相比,早期癌的5年生存率高达80～90%,可见提高卵巢癌的5年生存率的关键在于发现更多的早期病人。由于缺乏相应的高度特异性的标志物,卵巢癌的早期诊断仍是其研究的一个瓶颈问题,因此,卵巢癌的早期诊断仍是目前研究的热点。目前临床上多采用阴道B超结合CA125早期诊断卵巢癌,但是尽管这样也只能发现25%左右的早期病例,诊断性腹腔镜能够发现100%的卵巢癌病人,但是其有创伤性和昂贵的价格限制了其在临床上的广泛应用。卵巢癌早期诊断标志物的研究中,多数学者采用蛋白质组学方法进行筛选,其最大的优势在于能够从整体水平把握整个疾病的病理生理状态,传统的蛋白组学方法有2-DE、多维凝胶电泳,但是这些方法的可重复性较低且费时费力,近年来激光解析电离飞行时间质谱和基质辅助电离飞行时间质谱两大技术飞速发展,尤其是前者目前多用于血清标志物的筛选,但其可重复性仍然较差,随着研究的日益成熟,一些学者采用磁珠结合MALDI技术进行肿瘤标志物筛选的研究时发现该方法的可重复性较高,认为这与磁珠表面的疏水特性有关。较早的蛋白组学研究多采用血清标本来进行疾病蛋白质的筛选,近年来随着蛋白质分离技术、质谱分析技术和蛋白质数据库生物信息学技术的迅猛发展,唾液、胆汁、腹水、囊液等体液也被用来进行蛋白质组学的研究,目前多数研究仍集中在血清标志物筛选上,但血清蛋白来自全身,器官特异性较低,很难从大多数无症状人群中捕获尽可能多的真正患病的个体,相比较而言,各种体液蛋白质组学研究所筛选的标志物具有特异性高的优势。最近,虽有将卵巢癌患者的囊液和腹水用来筛选早期诊断标志物的研究,但是将各个期别的卵巢癌作为一个研究组与对照组进行对照研究,势必会遗漏一些早期病变的标志物。很显然,将卵巢癌分为早期组和晚期组,并将血清、腹水和囊液相结合用以筛选早期诊断的标志物,将会大大提高所筛选标志物的特异性和敏感性。因此本研究采用基于磁性微球的MALDI-TOF-MS、免疫组化、酶联免疫吸附试验技术,首先将卵巢癌患者分为早期组和晚期组分别与两个对照组进行比对研究,进一步在腹水和囊液中筛选卵巢癌相关侯选蛋白和早期诊断标志物,从蛋白水平探讨卵巢癌的血清和组织分子变化特征和规律,并采用小干扰RNA技术初步探讨筛选标志物的生物学功能,加深对卵巢癌癌变机制的了解,并为进一步发掘卵巢癌早期发现的分子指标和手段提供重要的理论基础和信息。2.材料与方法蛋白质组学实验：血清：训练集血清：卵巢癌患者30例(其中Ⅰ-Ⅱ期11例,Ⅲ～Ⅳ期19例,浆液性23例,粘液性6例,内膜样癌1例；<50岁9例,>50岁21例,家族史阳性10例,家族史阴性20例)、良性卵巢肿瘤10例(其中浆液性8例,粘液性2例)和正常卵巢者13例的血清和配对组织,5例卵巢癌患者的腹水和囊液,以上血清为训练集样本,验证集血清：卵巢癌8例(其中Ⅰ-Ⅱ期2例,Ⅲ-Ⅳ期6例)、5例卵巢良性肿瘤(其中浆液性4例,粘液性1例)和5例正常卵巢者的血清作为验证集样本。免疫组织化学实验：卵巢癌和正常卵巢组织为与以上训练集血清配对的组织共43例,良性卵巢肿瘤组织20例(与训练集血清配对组织10例,与验证集血清配对组织5例和额外收集组织5例)。酶联免疫吸附实验：卵巢癌和正常卵巢组为训练集加验证集血清共56例,良性卵巢肿瘤组25例(除训练集10例外,额外收集10例也作为训练集和验证集5例)。小干扰RNA实验：细胞：人卵巢癌细胞系ES2细胞在2006年7月至2009年1月收集术前日清晨空腹血5ml,离心后-80℃保存待用。组织均取自术中,10%福尔马林固定,石蜡包埋并以蜡块室温保存。所有病人术前均排除内外科合并症和肾功能不全,未经过放化疗和免疫治疗。术中收集腹水和囊液标本并避免被血液污染。取5μl血清样品,加入弱阳离子磁珠WCX (Bruker Daltonics, Leipzig Germany)混悬液SPE-CM2μl以及SPE-CB95μl,磁珠结合并贴壁后移去上清,再加入SPE-CW100μL,反复重复操作两次,得到制备好的血清样品。腹水和囊液的上样量分别为10μL和2.5μL,操作步骤和血清样品制备相同。将1μ1含蛋白质的洗脱液与10μl基质(0.3%的-α-氰基-4-羟基肉桂酸,HCCA)混合,取1μl点样于Anchorchip靶板上,将耙板放入Microflex质谱仪(Bruker Daltonics),用标准品(Clinprot standard)校正仪器后检测样品,获得不同质荷比的蛋白质峰构成的质谱图。在血清、腹水和囊液中筛选共同升高的多肽峰。然后在http://us.expasy.org/tools/tagident. html数据库中检索与之匹配的多肽。根据既往文献报道,甄别筛选出候选多肽进行下一步验证。采用免疫组化SP法检测卵巢癌组织、良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织的相应多肽的表达。GRP抗体(rabbit polyclonal, MAB35841 R&D Co, Ameraican)和二抗、DAB试剂盒均购自上海越研生物工程公司。实验按照试剂盒说明书进行。采用酶联免疫吸附试验检测卵巢癌组、良性卵巢肿瘤组和正常卵巢组的血清相应多肽的水平差异。GRP ELISA试剂盒(QC01-1, R & D Co, American)购自上海越研生物工程公司。Pro-GRP试剂盒(H23517,Ⅵ, American)。实验按照试剂盒说明书进行构建针对GRP的发夹样siRNA真核表达载体,人工合成GRPsiRNA的寡核苷酸链,导入p-Genesil-1.1载体(p-Genesil-1.1载体购自武汉晶赛生物技术工程公司),采用脂质体转染入人卵巢癌细胞系ES2细胞中,采用免疫印迹法(Western bloting)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测转染后GRPmRNA和蛋白表达变化,采用细胞计数法检测各组细胞增殖情况；流式细胞术观察被转染细胞的凋亡情况；transwell小室观察细胞被转染前后的穿膜侵袭力。采用ClinProtTM(Bruker Daltonics Company)的内置软件Flex Analysis 3.0收集所有样品的质谱峰,并分析单个峰的强度。采用Top Hat和Savitsky Golay系统进行平滑、去噪和归一化处理后采用遗传算法对多肽峰进行量化。采用ClinProtTM软件(Ver.2.2; Bruker Daltonics)将所有信噪比(S／N)>5的1000-10000Da范围内的信号进行处理。通过Kruskal-Wallis检验的P值评价每个差异峰的在不同组别的表达强度差异。采用线性支持向量机(SVM)区分各组的数据并建立诊断模型,以留一法分析诊断模型的诊断敏感度和特异度。筛选出的多肽峰的诊断意义用样品分布图和均值标准差图来表示。免疫组化的酶联免疫吸附试验的结果分别用χ2检验和方差分析(q-检验)、Kruskal-Wallis法进行分析。分别采用Spearman相关性分析评价卵巢癌组的免疫组化和ELISA结果一致性和Pearson相关性分析检验GRP和pro-GRP这两个血清指标的相关性,计算ELISA结果的95%的可信区间和敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。以Pearson相关系数表示差异多肽峰和血清多肽水平的相关性。各组的转染前后的蛋白、基因表达水平的变化和增殖、侵袭力变化采用两样本t检验分析。采用统计学软件SPSS13.0数据包进行统计分析。3结果卵巢癌组、良性组和正常组三组比较分析：良性与正常组相比无差异峰。与良性组相比,早、晚期卵巢癌组共同升高的多肽峰有2881和2897Da(P<0.05)；与正常组相比,早、晚期卵巢癌组共同升高的多肽峰有2881,2897和4466Da(P<0.05)。在4例卵巢癌患者的腹水和囊液中也发现2881和2897Da多肽峰均值较高。选择早晚期卵巢癌患者血清、腹水和囊液中共同升高的2881和2897Da差异峰采用GC算法建模,经留一法验证,诊断卵巢癌的特异度为100%,敏感度为100%,盲法检测的诊断特异度为100%,敏感度为87.5%。年龄<50岁和>50岁卵巢癌组与正常卵巢组相比无明显差异多肽峰(P均>0.05),家族史阳性与阴性的卵巢癌患者,血清多肽谱与正常卵巢组相比,仅有两个下调的多肽峰2953和1466Da一致(P<0.05),其余差异多肽峰均不同。在http://us.expasy.org/tools/tagident. html数据库中检索与2881和2897Da匹配的多肽,依据统计学分析及文献检索结果,在9种卵巢癌候选相关差异多肽中,仅胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide,GRP)在既往报道中较多提示与肿瘤密切相关,其余均未见报道与肿瘤有关。免疫组化结果显示,与良性(30%)和正常组(0%)相比,GRP在卵巢癌组织中显著高表达(早期：72.73%；晚期：78.95%),差异有显著性(χ2=24.599,P=0.00)。ELISA结果显示GRP在卵巢癌血清中显著高于良性和正常卵巢组(P<0.05)。Pearson相关性检验显示,卵巢癌患者的血清2881和2897Da差异多肽峰均值和标准差与GRP血清水平有明显相关性(r=0.92；r=0.88；P均<0.0001)。此外,卵巢癌组织和血清中的GRP呈正相关且一致性较高(r=0.809,P=0.000),GRP与其前体pro-GRP在训练集人群中有明显的相关性(r=0.90,P<0.001),且pro-GRP在训练集人群血清中的水平显著高于另外两组(χ2=41.81,P=0.00),其作为诊断指标的ROC面积为d.974(z=27.88,P<0.001),cut-off值为89.2851,用于诊断卵巢癌的灵敏度为100%,特异度为90.91%,Youden指数为0.9091。对验证集人群进行验证的灵敏度为93.33%,特异度为80%,Youden指数为0.7333。成功构建人GRP的发夹样siRNA真核表达载体GRPsiRNA,转染ES2细胞后,其增殖能力明显下降(P<0.05)；表达GRPmRNA和蛋白明显降低并且凋亡率显著下降；transwell小室显示其穿膜侵袭能力明显下降(P<0.05)。4结论4.1在早、晚期卵巢癌患者的血清中共同升高并在腹水和囊液也发现均值较高的2881和2897Da差异多肽峰,是高度特异和敏感的卵巢癌早期诊断候选标志物。家族史阳性和阴性的卵巢癌患者发病机理存在不同。4.2 GRP可能是与2881和2897Da相匹配的多肽,其前体pro-GRP对卵巢癌具有较高的早期诊断价值。4.3GRPsiRNA构建成功并转染ES2细胞可显著降低其增殖能力和穿膜侵袭力,并促进其凋亡