根管充填后长期残留在根管内的细菌是根管治疗失败的主要原因。粪肠球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)是顽固性或继发性根管内感染的主要致病菌，可以在营养物质缺乏、高碱性以及抗生素存在等恶劣环境中生存，其生存能力和致病性与其以生物膜形式存在密切相关。目前关于粪肠球菌生物膜的相关研究多以对数期或静止期粪肠球菌为研究对象。根管治疗后，根管内营养成分显著降低，粪肠球菌的生理状态可能为饥饿状态，表现为细菌表型改变，对药物、紫外照射等不良刺激具有更强的抵抗能力，同时基因表达水平发生变化，菌体内原有蛋白部分降解，饥饿蛋白合成。迄今的研究表明，饥饿状态下粪肠球菌可以形成生物膜，所形成的生物膜与对数期细菌在营养丰富条件下形成的生物膜具有不同的元素组成，但是形态结构特点有待于进一步阐明，在生物膜形成过程中菌体结构、生物大分子构象如何变化尚不清楚，生物膜的生理代谢、基因表达及调控机制亦未明确。　　 为此，本研究拟选用不同生理时期粪肠球菌形成单菌种生物膜，通过激光共聚焦扫描显微镜观察等方法了解饥饿状态下粪肠球菌生物膜的形态和结构特点。应用显微共焦拉曼光谱分析技术从分子水平获得生物膜状态下菌体生物大分子的组成和结构信息。在此基础上，采用粪肠球菌全基因组表达谱芯片和实时荧光定量PCR技术分析生物膜形成阶段特异性的基因表达，以期全面了解饥饿状态下粪肠球菌生物膜的基因转录调控机制。本研究分为三个部分：　　 第一章饥饿状态下粪肠球菌生物膜的结构特点。　　 目的：获得粪肠球菌单菌种生物膜，探讨饥饿期粪肠球菌所形成生物膜的形态和结构特点。　　 方法：诱导粪肠球菌进入对数期、静止期和饥饿期，体外培养获得粪肠球菌单菌种生物膜。采用激光共聚焦扫描显微镜、扫描电镜、活菌菌落计数法结合使用COMSTAT生物膜定量分析软件，探讨饥饿期粪肠球菌形成的生物膜内可培养细菌总数、生物膜厚度、生物量、粗糙度等形态结构特点。　　 结果：饥饿期粪肠球菌可以在牙本质等材料表面形成生物膜，经历粘附期、共聚期发展为三维网络或片状结构。在粘附材料和生物膜膜龄等因素固定的情况下，饥饿期粪肠球菌形成的生物膜内可培养细菌数量显著少于对数期和静止期细菌形成的生物膜(p＜0.05)。在牙本质表面，饥饿期粪肠球菌形成的生物膜厚度、生物量与对数期和静止期无明显差异(p＞0.05)，生物膜粗糙度大于对数期和静止期，且与静止期生物膜差异显著(p＜0.05)，提示饥饿期生物膜均质性较差。　　 结论：饥饿期粪肠球菌可以在牙本质等多种材料表面形成生物膜，具有生物膜形成的典型的发展阶段和三维网络或片状结构。生物膜内可培养细菌数量较少，表面不规则，均一性较差。表明饥饿期粪肠球菌可通过形成生物膜维持存活和致病性，借助生物膜结构的改变增加营养物质转运以适应内、外环境。　　 第二章饥饿状态下粪肠球菌生物膜的结构生物学研究。　　 目的：采集浮游状态下不同生理时期的粪肠球菌形成的48h生物膜细菌的拉曼光谱，从分子水平探讨饥饿期粪肠球菌形成生物膜的过程中生物大分子的构象变化。　　 方法：获得对数期、静止期和饥饿期粪肠球菌所形成的48h生物膜细胞，采用显微共焦拉曼光谱检测技术采集拉曼光谱并转换为ASCⅡ数据，应用MicroOrigin8.0、PeakFitv4.12等软件对数据进行扣背底、归一化及差谱分析，结合统计软件SPSS16.0进行主成分分析和判别分析。　　 结果：不同生理时期细菌形成的生物膜内细菌菌体结构有所差异。饥饿期粪肠球菌形成生物膜内的细菌菌体蛋白比例增加，DNA比例可能降低。在饥饿期浮游粪肠球菌形成生物膜过程中，菌体结构改变，生物膜内细菌DNA比例可能下降，蛋白比例上升并伴有构象变化。　　 结论：饥饿期粪肠球菌由浮游状态转变为生物膜状态，菌体内蛋白成分增加、构象转变。证明生物膜形成过程中菌体化学组成及代谢途径改变，细胞内生物大分子结构变化。饥饿期粪肠球菌合成生物膜特异性蛋白以适应环境变化。　　 第三章饥饿状态下粪肠球菌生物膜形成相关基因表达的实时分析。　　 目的：对饥饿期浮游粪肠球菌及其所形成的生物膜进行差异基因表达检测，从转录水平了解饥饿期粪肠球菌形成生物膜的代谢状况和调控机制。　　 方法：收集饥饿期浮游粪肠球菌及其所形成的4h、16h和48h生物膜，机械破壁结合Trizol法提取总RNA，经mRNA富集、纯化、标记后与Agilent粪肠球菌全基因组表达谱芯片进行杂交，芯片数据由Agilent Microarray Scanner扫描，经Agilent Feature Extraction(FE)software读取。应用分析软件Agilent GeneSpringGX software(version11.0)进行数据均一化处理。采用统计软件SPSS16.0进行统计学分析。差异表达基因参照KEGG，NCBI数据库信息进行注释分析。采用实时荧光定量PCR技术对部分差异表达基因进一步验证。　　 结果：在饥饿期粪肠球菌形成生物膜的过程中，6-13％的基因表达水平改变。EF1009等DNA合成、复制相关基因表达下调，rpsM等核糖体编码基因、甘氨酸、含硫氨基酸等代谢通路相关基因差异表达。murG等参与细胞壁肽聚糖及其他胞外被膜结构形成的基因表达增强，ABC转运器、PTS转运系统以及fsr、TetR家族转录调节因子等表达水平变化显著。实时荧光定量PCR和基因芯片检测基因变化趋势一致。　　 结论：生物膜形成过程中，饥饿期粪肠球菌可以降低生物膜内细菌复制周期及代谢水平、减弱次级代谢产物的转运利用以获得细菌生存的必需能量和降低对外界刺激的敏感性，同时改变蛋白合成的种类、速率以提供生物膜形成的物质基础，加强细胞壁和其他表面结构的生物合成以促进其粘附、固定并减少外来物质的渗入，启动fsr、TetR家族转录调节因子等调控系统以促进生物膜的形成。