论文部分内容阅读
地球早期生命和逆境条件下的现代生物似乎依赖焦磷酸（PPi）而不是腺苷三磷酸（ATP）作为主要能源来维持存在。其中,由PPi驱动的二聚体形式膜整合焦磷酸酶（PPase）起着重要作用,它包括H+-PPase、Na+-PPase和Na+,H+-PPase三个亚家族。H+-PPase早被人所知,分布最为广泛,有着大量的功能研究,而且在构建抗逆生物尤其是植物方面的应用已十分引人瞩目。相比较,其它两个亚家族PPase（Na+-PPase和Na+,H+-PPase）几年前或最近仅在原核生物中发现,目前还没有任何关于它们的应用研究报道。本工作特地针对人肠道甲基戊糖梭菌（Clostridium methylpentosum）的膜整合焦磷酸酶（推测是Na+,H+-PPase亚家族成员）,对其进行基因克隆和抗盐功能分析,主要结果如下:（1）CmPP的基因克隆、生物信息学分析及其重组大肠杆菌的抗盐性分析以人肠道宏基因组DNA为模板,采用两轮PCR扩增得到了CmPP全长基因,通过酶切直接克隆到了大肠杆菌载体pET32a（+）中,构建了其原核表达载体pET（CmPP）。序列分析表明该基因包含一个完整的ORF（2100bp）,编码一个699aa的蛋白质（理论分子量为72.3kDa,等电点为6.14）,G+C含量为59.9%,碱基分布均衡,内部没有隐含的聚腺苷化信号。膜拓扑学结构预测CmPP是一个由16个跨膜螺旋组成的膜蛋白,与目前已经鉴定过的膜PPase的跨膜结构相符。系统进化树分析推测CmPP属于Na+,H+-PPase亚家族成员,与已被鉴定的、共存于人肠道的厌氧柔嫩梭菌膜整合焦磷酸酶（GenBank Acc.No.ZP02078667）的亲缘关系最近。将原核表达载体pET（CmPP）转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,得到CmPP重组大肠杆菌。通过菌落稀释点板实验和生长曲线测定分析,发现其在盐胁迫（0.7M,0.8M,0.9M NaCl）下的生长明显好于含pET32a（+）质粒的对照菌,表明异源表达CmPP能够提高大肠杆菌的耐盐性。（2）CmPP重组酵母菌的抗盐性分析通过酶切将载体pET（CmPP）上的CmPP基因片段克隆到酵母质粒pYES2中,构建酵母表达载体pYES2（CmPP）,并将其转化酿酒酵母盐敏感突变体菌株ena1-,得到CmPP重组酵母菌。通过菌落稀释点板实验和生长曲线测定分析,发现其在盐胁迫下（0.2M,0.25M,0.3M NaCl）的生长明显好于含pYES2质粒的酵母对照菌,表明异源表达CmPP还能够提高酿酒酵母的耐盐性。（3）CmPP转基因烟草的抗盐性分析以已构建的pET（CmPP）质粒为模板,再扩增得到CmPP基因片段,然后通过酶切克隆到质粒pBI121中,构建植物表达载体pBI121（CmPP）,并将其转化到根癌农杆菌LBA4404中。通过农杆菌侵染的叶盘转化法和多重PCR鉴定,获得了阳性CmPP转基因烟草植株。挑选CmPP转基因当代植株抗盐测试效果较好的3个株系（9号、11号、12号）,对其子一代植株进行进一步抗盐性分析。结果发现,盐胁迫下转基因植株的生长要好于野生型植株,而且离体叶片失绿程度要低。当受到盐胁迫时,野生型烟草和CmPP转基因烟草的各部分（根、茎、叶）干物质含量、总叶绿素含量、根系活力急剧下降,但是所有3个转基因株系的下降程度均显著低于野生型烟草。同时,随着盐浓度的增加,叶片MDA含量和电解质渗透率在野生型植株和转基因烟草中均呈现不断增加趋势,但在相同盐胁迫条件下,这两个指标值在3个转基因株系中均显著低于野生型植株。以上结果清楚说明CmPP基因的导入提高了转基因烟草的抗盐能力。总之,就目前文献资料判断,本工作可能是首次对具有Na+转运活性的膜PPase的功能性应用进行报道。CmPP在细菌、酵母和烟草中异源表达都表现出抗盐效果,推测可能主要归因于它的Na+泵活性,使得细胞质内Na+排至胞外或液泡中,从而减轻盐对细胞的毒性。因此,不难想象,CmPP在植物特别是农作物的抗盐基因工程中应该具有潜在的应用前景。