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抑制素(Inhibin,Inn)通过反馈作用抑制促卵泡素的合成与分泌,影响动物的卵泡发育和排卵。为探讨应用RNAi技术沉默INH-α基因提高水牛繁殖力的可行性,本研究构建了水牛抑制素α亚基的RNAi载体,并在细胞水平对其沉默效率进行了检测。
1.以pSliencer4.1-CMV neo载体为骨架,设计并构建了pSliencer4.1-145、pSliencer4.1-308、pSliencer4.1-769、pSliencer4.1-1013和pSliencer4.1-1053共5个针对水牛INH-α基因的RNAi载体。载体用脂质体法转染水牛颗粒细胞,48h后应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行沉默效率的检测。结果显示:针对308、769、1013和1053位点的抑制效率分别为58.8％、44.9％、67.4％和43.9％,145位点无抑制效果。选择抑制效率最高的pSliencer4.1-1013转染颗粒细胞,检测24h、48h、72h和96h后的抑制效率表明基因沉默具有时效性,转染48h后抑制效率最高,此后逐渐减弱。
2.以1013位点为核心序列,设计并构建了以pSico-PGK1为骨架的RNAi慢病毒载体pSico-PGK1-CMV-1013。通过pSico-PGK1-CMV-1013、psPAX2和pCMV-VSV-G质粒共转染293T细胞包装病毒,经批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度达到4x107 IU/mL,用病毒感染水牛颗粒细胞72h后,qRT-PCR检测INH-α的抑制效率为26.8％。
3.探讨了应用microRNA原理进行卵巢组织特异性沉默水牛INH的可行性。设计并构建了2个以pEGFP-C1为骨架基于内含子microRNA原理的干扰载体pEGFP-C1-18a-1013和pEGFP-C1-155-1013。转染颗粒细胞48h后的检测结果显示pEGFP-C1-155-1013具有49.4％的抑制效率,而pEGFP-C1-18a-1013未表现抑制作用。
上述结果表明:筛选得到的水牛INH-α基因308、769、1013和1053四个shRNA核心序列位点能有效抑制INH-α的表达,其中1013位点抑制效率最高达到67.4％;构建得到的pSico-PGK1-CMV-1013慢病毒载体和miRNA干扰载体pEGFP-C1-155-1013,可用于制作INH-α沉默的转基因水牛。