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研究背景：随着城市化脚步的进一步加快,人们生活习惯的不断改变,使得世界范围内乳腺癌的发病率逐年上升。据国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)最近报道,世界各地的乳腺癌在妇女癌症中约占23%,是女性死亡的首要原因。目前,我国年龄标化的乳腺癌发病率高达18.7/10万。近年来随着人们对乳腺癌的进一步认识,临床研究不断深入,乳腺癌的治疗已经取得了巨大成就。西医对乳腺癌的治疗疗效已得到肯定,却也引起了耐药以及化疗药物的毒性反应,严重限制了其临床应用。因而祖国医学在乳腺癌综合治疗中的优势日益受到人们的关注。随着中医药研究的逐步发展,中医药在临床应用的日益增多,以中西医结合的综合治疗已成为包括乳腺癌在内的多种肿瘤的首选,并取得了良好的近期和远期疗效。姜黄素,是从中药姜黄、郁金、莪术等中草药中提取的具有抗肿瘤活性的天然成分,在乳腺癌治疗中有着良好的增效减毒、扶正祛邪的作用,显示了良好的应用前景,但其具体机制仍未明确。而自噬与内质网应激在肿瘤的发生发展、浸润、转移和凋亡过程中发挥着重要的作用,是目前国内外学者研究的热点问题。本课题旨在研究中药活性成分姜黄素对乳腺癌细胞自噬和内质网应激通路的影响,探索这些扶正祛邪、阴阳调和类活性成分治疗乳腺癌的微观机制,为临床使用姜黄素治疗乳腺癌提供实验依据,进一步为中西医结合为基础的综合治疗方式提供借鉴。研究目的：1、阐明姜黄素在乳腺癌治疗中所发挥的作用及其中医理论基础,进一步为中西医结合治疗乳腺癌及临床其他肿瘤的治疗提供微观依据；2、探索姜黄素治疗乳腺癌的具体机制,尤其是姜黄素对乳腺癌细胞自噬和内质网应激通路的影响,为临床开发新颖的治疗靶点和制剂提供实验依据,从而改善患者的生命质量；研究方法：采用理论研究和实验研究相结合的方法。1、理论研究1.1对国内外,古代与近代有关于乳腺癌的文献记载进行收集、整理,全面了解乳腺癌的发生发展,具体包括流行病学研究、遗传学研究、乳腺癌发病的危险因素及乳腺癌的预防策略。1.2对乳腺癌有关的中西医理论、及临床实践进行归纳、总结,从而更深一步探索乳腺癌的治疗在中西医各自的优势,为治疗乳腺癌寻找更多中西医结合的综合治疗手段。2、实验研究2.1 MTT法检测姜黄素对人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞存活率的影响：将不同浓度姜黄素处理各组处于对数生长期的乳腺癌细胞,以MTT法检测姜黄素对MCF-7、MDA-MB-231细胞有无抑制作用及作用强度,并以此筛选有效抑制浓度；2.2 Western Blot检测姜黄素对人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞自噬、内质网应激相关蛋白的表达：以不同浓度姜黄素处理各组乳腺癌细胞后,提取细胞蛋白质,利用Western Blot技术分析自噬标志蛋白(Beclinl、LC3)、内质网应激相关蛋白(GRP78、p-PERK、p-eIF2α、IRE1)的表达水平,以此进一步证实姜黄素对乳腺癌细胞自噬及内质网应激的影响。2.3以自噬抑制剂预处理乳腺癌细胞：以自噬抑制剂(氯喹/CQ,3-甲基腺嘌呤/3-MA)预处理乳腺癌细胞,调控细胞自噬状态再以姜黄素处理一定时间。分别以MTT法检测细胞存活率,以Western Blot分析自噬蛋白(LC3、Beclinl)的表达来确定自噬水平的变化。2.4基因干扰(敲减)Atg5抑制乳腺癌细胞的自噬：Atg5是自噬的启动子之一,将siRNA转染后的乳腺癌细胞以姜黄素处理24h,在基因水平抑制自噬的启动,再以MTT法检测细胞存活率,以Western Blot检测自噬标志性蛋白(Beclin1、LC3)的表达来确认自噬状态的改变。2.5以内质网应激反应抑制剂及诱导剂预处理乳腺癌细胞：以内质网应激反应抑制剂(4-PBA/Sal)、内质网应激反应诱导剂(2-DG/DTTox)预处理乳腺癌细胞,调节内质网应激的反应能力,再以姜黄素处理一定时间。分别以MTT法检测细胞存活率,以Western Blot分析内质网应激相关蛋白(GRP78或p-PERK)的表达水平来明确内质网应激反应的变化。研究结果：1、姜黄素对MCF-7、MDA-MB-231细胞具有明显增殖抑制的作用,且随药物浓度增加抑制作用增强,呈现剂量依赖关系。2、Western Blot结果表明姜黄素促进自噬蛋白Beclinl蛋白表达及LC3B-I向LC3B-II的转化。3、当以氯喹预处理细胞后,再以姜黄素处理后发现,姜黄素进一步升高了LC3-II的水平。因为氯喹可抑制自噬溶酶体的降解从而增加LC3-Ⅱ的积聚,提示姜黄素可能是促进LC3I向LC3-Ⅱ的转化,加快自噬体的形成。4、以Atg5 siRNA预处理后,可以缓解姜黄素对细胞增殖的抑制作用,表明姜黄素是通过诱导MCF-7/MDA-MB-231细胞自噬来抑制细胞增殖。5、Western Blot结果表明姜黄素提高了内质网应激相关蛋白(GRP78、p-PERK、p-eIF2α蛋白)的表达水平,提示姜黄素激发了内质网应激反应。6、以内质网应激反应抑制剂(4-PBA/Sal)分别预处理乳腺癌细胞12h抑制内质网应激反应后,再以姜黄素处理,发现姜黄素对乳腺癌细胞的增殖抑制效应明显增强。结论：中药活性成分姜黄素可以通过诱导细胞自噬来抑制人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞的增殖。同时,姜黄素还可以激活内质网应激,提示内质网应激也参与了姜黄素对人乳腺癌细胞的增殖抑制作用,这将为姜黄素的临床应用提供新的方向。本研究为姜黄素抗癌作用的机制及临床应用提供新的方向。