论文部分内容阅读
第一部分SNHG5与EMT标志物在胃癌组织、外周血中的表达及其相关性研究目的:研究SNHG5及EMT标志物在胃癌组织和外周血中的表达,并分析其相关性。方法:1通过RT-qPCR技术检测胃癌组织及对应的癌旁组织中SNHG5、CDH1、N-cadherin及Vimentin的表达,并分析SNHG5与EMT标志物表达水平的相关性。2通过RT-qPCR技术检测胃癌患者外周血中SNHG5、CDH1、N-cadherin及Vimentin的表达,并分析SNHG5与EMT标志物表达的相关性。3通过免疫组化技术检测胃癌组织及对应的癌旁组织中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin的表达情况。4通过对RT-qPCR数据及免疫组化检测数据的分析,研究SNHG5与EMT相关蛋白表达的相关性。结果:1.RT-qPCR法分析结果显示,于对应的癌旁组织相比,SNHG5及CDH1在胃癌组织中明显低表达(P<0.001;P<0.001),而N-cadherin和Vimentin在胃癌组织中明显高表达(P<0.001;P<0.001),且SNHG5与CDH1的表达呈明显正相关(r=0.630,P<0.001),而与N-cadherin和Vimentin的表达呈明显负相关(r=-0.577,P<0.001;r=-0.525,P<0.001)。2.RT-qPCR法分析结果表明,胃癌患者血清中SNHG5与CDH1的表达呈正相关(r=0.834,P<0.001),而与N-cadherin和Vimentin的表达呈负相关(r=-0.427,P<0.001;r=-0.642,P<0.001)。3.免疫组化法分析结果显示,E-cadherin在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.001),而N-cadherin和Vimentin在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.001;P<0.001)。4.通过对RT-qPCR及免疫组化法检测数据的分析表明,SNHG5的表达与E-cadherin蛋白表达呈正相关(P<0.001),而与N-cadherin和Vimentin蛋白表达呈负相关(P<0.001;P<0.001)。第二部分SNHG5在体外参与调控EMT及其对胃癌细胞生物学行为的影响目的:研究SNHG5对胃癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的影响及其对胃癌细胞EMT的作用。方法:1通过Western blot实验检测胃癌细胞系EMT相关蛋白的表达,筛选细胞一种偏向于上皮细胞的胃癌细胞(E-cadherin表达较高,N-cadherin和Vimentin表达较低)和一种偏向于间质细胞的胃癌细胞(E-cadherin表达较低,N-cadherin和Vimentin表达较高)进行体内外实验。2通过MTS、划痕愈合、Transwell迁移和侵袭实验检测过表达或敲低SNHG5表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。3通过Western bolt和细胞免疫荧光(IF)实验检测过表达或敲低SNHG5对胃癌细胞EMT相关蛋白表达的影响。结果:1.通过Western blot实验检测胃癌细胞系EMT相关蛋白的表达,选择偏向于间质细胞的SGC-7901细胞和偏向于上皮细胞的MGC-803细胞进行体内外实验。2.MTS实验结果显示,过表达或敲低SNHG5表达均不影响胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的增殖能力(P>0.05;P>0.05)。3.划痕愈合实验显示,过表达SNHG5显著减弱胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的迁移能力(P<0.001;P<0.001),而敲低SNHG5表达显著增强胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的迁移能力(P<0.001;P<0.001)。4.Transwell小室迁移实验显示,过表达SNHG5显著减弱胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的迁移能力(P<0.001;P<0.001),而敲低SNHG5表达显著增强胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的迁移能力(P<0.001;P<0.001)。5.Transwell小室侵袭实验显示,过表达SNHG5显著减弱胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的侵袭能力(P<0.001;P<0.001),而敲低SNHG5表达显著增强胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的侵袭能力(P<0.001;P<0.001)。6.Western blot实验显示,过表达SNHG5使胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的E-cadherin表达增加(P<0.001,P<0.01),N-cadherin和Vimentin表达减少(P<0.001,P<0.001;P<0.05,P<0.001),表明过表达SNHG5可以抑制胃癌细胞EMT。敲低SNHG5表达使胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的E-cadherin表达减少(P<0.01,P<0.01),N-cadherin和Vimentin表达增加(P<0.001,P<0.001;P<0.01,P<0.01),表明敲低SNHG5表达可以促进胃癌细胞EMT。7.细胞免疫荧光实验显示,过表达SNHG5使胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的E-cadherin表达增加,N-cadherin和Vimentin表达减少,表明过表达SNHG5可以抑制胃癌细胞EMT。敲低SNHG5表达使胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的E-cadherin表达减少,N-cadherin和Vimentin表达增加,表明敲低SNHG5可以促进胃癌细胞EMT。第三部分探讨SNHG5调控EMT的机制及对逆转荷瘤裸鼠体内胃癌细胞EMT作用的研究目的:探讨SNHG5调节EMT的过程与Twist/Mi2/NuRD复合物的形成和作用机制及其对逆转裸鼠体内胃癌细胞EMT的作用。方法:1通过细胞核浆分离和Western blot实验检测过表达SNHG5对胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中MTA2及Twist亚细胞定位的影响。2通过细胞免疫荧光实验检测过表达SNHG5对胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中MTA2及Twist亚细胞定位及其结合的影响。3通过染色质免疫共沉淀实验检测过表达SNHG5对Twist与E-cadherin启动子区结合能力的影响。4通过裸鼠荷瘤实验检测SNHG5过表达对逆转裸鼠体内胃癌细胞EMT的作用。结果:1.细胞核浆分离及Western blot实验结果显示,胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中MTA2及Twist主要在细胞核中表达,过表达SNHG5可使细胞核中的MTA2及Twist表达减少(P<0.01),细胞浆中的MTA2及Twist表达增加(P<0.01),表明SNHG5可阻止MTA2和Twist进入细胞核。2.细胞免疫荧光实验结果显示,胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中MTA2及Twist主要在细胞核中表达,过表达SNHG5可使细胞核中的MTA2及Twist表达减少,细胞浆中的MTA2及Twist表达增加,表明SNHG5可阻止MTA2和Twist进入细胞核。共定位实验显示,过表达SNHG5后MTA2与Twist蛋白的结合减少,表明SNHG5可抑制MTA2与Twist蛋白的结合。3.染色质免疫共沉淀实验显示在胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中过表达SNHG5可以抑制Twist与E-cadherin启动子区的结合(P<0.01),逆转Twist对E-cadherin表达的抑制作用。4.裸鼠荷瘤实验表明在胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中SNHG5过表达可阻止荷胃癌细胞裸鼠体内肿瘤组织的EMT进展。结论:SNHG5和E-cadherin在胃癌患者肿瘤组织中低表达,N-cadherin及Vimentin在胃癌患者肿瘤组织中高表达,且在胃癌患者组织及外周血中SNHG5与E-cadherin的表达呈明显正相关,而与N-cadherin及Vimentin的表达呈明显负相关,说明胃癌发生发展过程中发生一定程度EMT,且SNHG5可能负向调控EMT进程。过表达SNHG5可以显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力,敲低SNHG5表达则可以显著增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力。过表达SNHG5可以抑制胃癌细胞EMT,而敲低SNHG5表达可以促进胃癌细胞EMT。SNHG5可阻止MTA2和Twist进入细胞核,抑制MTA2与Twist蛋白的结合,并可以抑制Twist与E-cadherin启动子区的结合,从而阻止Twist/Mi2/NuRD复合物结合至E-cadherin的启动子区,进而逆转该复合物对E-cadherin表达的抑制。体内实验表明SNHG5过表达可阻止荷胃癌细胞裸鼠体内肿瘤组织的EMT进展。