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沙棘木蠹蛾Eogystia hippophaecola(Hua,Chou,Fang&Chen)隶属鳞翅目Lepidoptera、木蠹蛾科Cossidae的Eogystia属,是中国特有的严重危害内蒙、辽宁、宁夏等地区人工沙棘林Hippophae rhamnoides生态和经济效益的钻蛀性害虫,主要以幼虫取食沙棘的根部和干部,能够在沙棘根部越冬,具有较强的耐寒能力。而热激蛋白90(Heat-shock proteins 90,Hsp90)与昆虫的高低温耐受能力密切相关。为了揭示沙棘木蠹蛾幼虫耐受寒冷的适应机制,本研究基于转录组深度测序结果筛选出两条Hsp90基因并进行克隆,分别命名Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2;利用q RT-PCR技术分析了两个Hsp90基因在沙棘木蠹蛾幼虫遭受低温胁迫时的表达规律;将克隆测序正确的Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2基因连接到p ET30a原核表达载体且成功表达目的蛋白;比较不同ds RNA注射剂量和干扰时间对Eh Hsp90-1基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率的影响。结果如下:1.获得了Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2基因完整的开放阅读框(Open read frame,ORF)和氨基酸序列。Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2基因ORF全长分别为2154bp和2346bp,编码717和781个氨基酸,预测其分子量为82.5KDa和88.8KDa。两条基因序列均包含Hsp90家族的特征序列,依据C端的特征序列可分为细胞质型Hsp90和内质网型Hsp90,且与多种鳞翅目昆虫的Hsp90氨基酸序列有较高的同源性,表明Hsp90具有高度保守性。2.明确了Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2基因在同一时间不同温度和同一温度不同时间下的表达规律。在不同低温胁迫2h的处理后,Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2的表达规律相似,均表现为先上升后下降。而在-5℃胁迫不同时间后,Eh Hsp90-1在低温胁迫12h后出现表达量显著上调,而Eh Hsp90-2是快速响应的热激蛋白,在胁迫1h后显著上调,2h达到最高,但整体上调水平相比Eh Hsp90-1较低,表明Eh Hsp90-1基因在沙棘木蠹蛾幼虫应对低温胁迫的响应中发挥更显著的作用。3.诱导了Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2蛋白在体外的准确表达。将两个基因与p ET30a表达载体连接并成功转入大肠杆菌,通过IPTG诱导后均在上清液中检测到预期分子量的重组蛋白,表明两个热激蛋白成功在体外表达且均为可溶性蛋白。利用制备的多克隆抗体对沙棘木蠹蛾幼虫体内的Hsp90蛋白进行免疫印迹检测,得到很好的特异性结合,表明基因克隆序列准确且蛋白表达成功。4.初步构建了Eh Hsp90-1基因有效的RNAi体系。比较不同ds RNA注射剂量和干扰时间下Eh Hsp90-1基因的表达量,得出能够有效干扰Eh Hsp90-1基因的体系为注射5μg(1μg/μL)ds RNA以及持续干扰72h的结果,为后续进一步分析基因功能提供参考。