研究目的:维持基因组的稳定性对于细胞和有机体的存活健康是至关重要的。DNA会受到来自环境和内部代谢过程中的多种影响,因此维持基因组的稳定性具有一定的挑战。环境造成的DNA损伤主要由物理或化学物质产生。物理基因毒性剂如电离辐射(ionizing radiation,IR)和紫外线辐射(ultraviolet,UV)会导致每个细胞每天发生约105次DNA损伤(嘧啶二聚体和光产物)。电离辐射(宇宙射线和放射治疗)会导致DNA氧化产生单链或双链DNA断裂。电离辐射诱导的DNA损伤应答和DNA修复非常复杂,尽管近年来对其了解不断深入,但是还有许多值得探索的地方,尤其RecQ介导的基因组不稳定蛋白1(RecQ-mediated genome instability 1,RMI1)及BTR(BLM-TopoⅢα-RMI1)复合物在其中的调控作用机制尚不明了。因此本课题研究RMI1在IR诱导DNA损伤应答和DNA修复中的调控作用及其相关的分子机制,对于探索IR诱导DNA损伤机制具有重要意义。此外,放射治疗是肿瘤治疗的一个重要手段,放射抵抗是目前治疗存在的难点。因此,本研究的分子调控机制也可以为发现新的肿瘤放疗增敏靶点提供了理论依据。研究方法:1.研究缺失RMI1细胞对电离辐射的敏感性。用慢病毒介导的RMI1 shRNA将细胞中的RMI1基因沉默后,用不同剂量的γ射线照射细胞,然后采用直接计数或者集落存活实验(Clonogenic survival assay)来评价RMI1缺失细胞对IR敏感性的影响。然后通过流式细胞术来定量被Annexin V-FITC标记的凋亡细胞,以确定增强的敏感性是否是由更多的细胞凋亡引起的。2.研究缺失RMI1细胞对IR诱导DNA损伤的修复功能。通过单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)检测细胞中受损DNA并予以定量。将RMI1敲降细胞和对照组细胞,经不同剂量Y射线照射,然后使用单细胞凝胶电泳技术来对比这两种细胞中断裂DNA的量,评价RMI1在IR诱导DNA损伤修复中的作用。3.研究缺失RMI1细胞对γH2AX和53BP1 foci的影响。通过免疫荧光检测细胞中γH2AX和53BP1 foci的水平。将RMI1缺失或对照组细胞,经γ射线照射后,检测yH2AX和53BP1 foci的水平,进一步评价RMI1对IR诱导DNA损伤修复的影响。4.研究缺失RMI1细胞对IR诱导基因组稳定性的影响。通过微核和染色体实验检测细胞基因组稳定性。将RMI1缺失或对照组细胞,经γ射线照射后,在不同时间点收集细胞,通过微核实验检测双核细胞中的微核发生率;然后通过染色体实验统计异常染色体的数目,评价RMI1在IR影响基因组稳定性中的功能。5.研究缺失RMI1细胞对DSBs修复途径同源重组和非同源末端连接的影响。基于I-SceI的U20S DR-GFP同源重组检测系统和U20S EJ5-GFP非同源末端连接检测系统。转染外源的I-Sce I诱导酶切位点处发生双链断裂,通过流式细胞术检测RMI1敲降对同源重组修复效率和非同源末端连接修复效率的影响。6.研究RMI1缺失对IR诱导的DNA损伤应答和细胞周期分布的影响。通过western blot研究RMI1缺失对细胞周期检验点的影响。利用流式细胞术检测细胞中的DNA含量比较缺失RMI1细胞与对照组细胞的细胞周期分布,明确RMI1是否在IR诱导DNA损伤应答过程中发挥作用。研究结果:1.RMI1沉默细胞对IR敏感性增强,凋亡的细胞比例增多。2.RMI1沉默降低细胞IR诱导DNA损伤的修复功能。3.RMI1沉默增加IR后的γH2AX和53BPlfoci的水平。4.RMI1沉默细胞基因组稳定性降低。5.RMI1沉默细胞同源重组修复效率降低,但不影响非同源末端连接修复效率。6.RMI1沉默激活IR诱导的细胞周期检验点,使停滞在G2/M期的细胞比例增多。研究结论:RMI1沉默降低同源重组修复效率,影响DNA损伤修复,激活细胞周期检验点,在IR诱导的DNA损伤应答过程中发挥重要作用。研究目的:维持基因组的稳定性对于遗传信息的忠实传递和防止由各种DNA损伤事件引起的突变是至关重要的。DNA会受到来自环境和内部代谢过程中多种影响,因此维持基因组的稳定性具有一定的挑战。环境造成的DNA损伤主要由物理或化学物质产生。用于癌症化疗的化学试剂会引起多种损伤:烷化剂将烷基基团附着在DNA碱基上,如甲基甲烷磺酰(methyl-methane sulfonate,MMS)和替莫挫胺(temozolomide);交联剂会引起同一 DNA链或不同DNA链的碱基之间产生交联(interstrandcrosslinks,ICLs),如丝裂霉素 C(mitomycinC,MMC),顺铂;其他的化学制剂,如拓扑异构酶抑制剂,喜树碱(camptothecin,CPT)和依托泊苷(etoposide)分别是拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的抑制剂,通过影响拓扑异构酶与DNA形成的共价复合物诱导DSBs和SSBs的形成。RecQ介导的基因组不稳定蛋白1(RecQ-mediated genome instability 1,RMI1)是 BLM 和 TopoⅢα 复合物之一,对于维持基因组的稳定性至关重要。但RMI1及BTR复合物在CPT诱导的DNA损伤中的调控作用机制尚不明了,因此本课题研究了RMI1在CPT诱导的DSBs修复中的调控作用及其相关的分子机制。研究内容:1.研究缺失RMI1细胞对MMS和CPT的敏感性。用慢病毒介导的RMI1 shRNA将HeLa细胞中的RMI1基因沉默后,用不同浓度的CPT或MMS处理细胞,然后通过克隆形成率评价RMI1缺失细胞对基因毒性剂敏感性的影响。2.研究缺失RMI1细胞对CPT诱导DNA损伤的影响。通过单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)检测细胞中受损DNA并予以定量。将用RMI1缺失或对照组细胞,经CPT处理后,使用单细胞凝胶电泳来对比这两种细胞中断裂DNA的量,评价RMI1在CPT诱导DNA损伤修复中的作用。然后在RMI1缺失的细胞中回补RMI1,进一步确定RMI1在DNA损伤修复中的功能。3.研究缺失RMI1细胞对γH2AX和53BP1foci的影响。通过免疫荧光检测细胞中γH2AX和53BP1foci的水平。将RMI1缺失或对照组细胞,经CPT处理后,检测yH2AX和53BP1foci的水平,进一步评价RMI1对DNA损伤修复功能的影响。4.研究RMI1缺失细胞对CPT诱导DNA损伤应答的影响。通过western blot研究RMI1缺失对DNA损伤应答蛋白的影响。利用流式细胞术来检测细胞中的DNA含量比较缺失RMI1细胞与对照组细胞的细胞周期分布,明确RMI1是否在DNA损伤应答过程中发挥作用。5.研究在缺失RMI1细胞对DNA损伤时RAD51招募的影响。通过免疫荧光检测RMI1缺失细胞是否影响RAD51的招募。进一步在HeLa野生型细胞中检测CPT诱导DNA损伤时,RMI1能否与RAD51共定位,最后通过免疫共沉淀研究RMI1能否与RAD51相互作用,进而影响RAD51的募集。6.研究RMI1能否应答CPT诱导的DNA损伤。通过免疫荧光检测HeLa细胞经CPT诱导DNA损伤时,RMI1能否形成核聚集体应答DSBs;通过western blot检测CPT处理后RMI1蛋白水平的变化。7.研究RMI1应答CPT诱导的DNA损伤是否依赖于BTR复合物。在RMI1沉默细胞中,进一步通过siRNA敲降BLM或TopoⅢα,经CPT处理后,通过免疫荧光检测γH2AX foci的水平,评价RMI1应答DSBs是否依赖于BTR复合物。研究结果:1.RMI1沉默细胞对基因毒性剂(MMS和CPT)的敏感性增强。2.RMI1沉默降低CPT诱导的DNA损伤修复功能。3.RMI1沉默细胞经CPT处理后yH2AX和53BP1 foci 水平增加。4.RMI1沉默细胞对CPT诱导DNA损伤的应答反应增强,细胞周期阻滞在G2/M期的细胞比例增多。5.RMI1与RAD51相互作用,RMI1沉默影响RAD51募集到DSBs。6.RMI1形成核聚集体应答CPT诱导的DSBs,并且RMI1的蛋白水平增加。7.RMI1应答CPT诱导的DSBs部分依赖于BTR复合物。研究结论:本研究中,我们发现RMI1沉默增加细胞对基因毒性剂的敏感性,增加CPT诱导的DSBs,激活DNA损伤应答,引起了更多G2/M细胞周期阻滞。DNA发生损伤时,RMI1形成核聚集体应答DNA损伤,并且与RAD51相互作用,促进RAD51的招募起始同源重组。这些结果表明RMI1在应答DNA损伤时具有重要的作用,为RMI1在维持基因组稳定性分子机制提供了理论基础。研究目的:RMI1(RecQ-mediated genome instability protein 1)与 BLM,Topo Ⅲα 和RM12形成BTR复合物,对于维持基因组的稳定性是很关键的。RMI1蛋白功能缺失会引起基因组不稳定性,包括姐妹染色单体交换增加。前期研究表明在应答复制应激时RMI1与BLM、Topo Ⅲα形成核聚集体应答复制应激,并且RMI1作用于BLM的下游促进停滞复制叉的延长,但是在复制应激时RMI1的功能是不明确的。羟基脲(hydroxyurea,HU)会导致脱氧核糖核酸酶三磷酸的缺失(deoxynucleoside triphosphates,dNTPs),抑制复制多聚酶的活性,从多聚酶上解偶联复制解旋酶,从而产生更多的ssDNA。本课题研究了 RMI1在羟基脲诱导DNA复制应激中的作用。研究内容:1.RMI1能否应答HU诱导的复制应激。通过流式细胞术检测HU处理后细胞DNA含量,确定复制应激。然后通过免疫荧光检测HeLa细胞经HU诱导复制应激时,RMI1能否形成核聚集体应答复制应激。2.研究缺失RMI1细胞对HU的敏感性。用慢病毒介导的RMI1 shRNA将细胞中的RMI1基因沉默后,用不同浓度的HU处理细胞,然后通过克隆形成率来评价RMI1缺失细胞对HU敏感性的影响。进一步通过流式细胞术来定量被Annexin V-FITC标记的凋亡细胞,以确定增强的敏感性是否是由更多的细胞凋亡所引起。3.研究缺失RMI1细胞对HU诱导复制应激时DNA损伤修复能力的影响。通过单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)检测细胞中受损DNA并予以定量的方法。将HeLashRMI1和shControl用HU处理后,通过单细胞凝胶电泳分析这两种细胞中断裂DNA的量,评价RMI1在复制应激时对DNA损伤修复的影响。4.研究RMI1缺失细胞对HU诱导DNA损伤应答的反应。通过western blot分析RMI1缺失对DNA损伤应答蛋白的影响。利用流式细胞术检测细胞中的DNA含量,比较缺失RMI1的细胞与对照组细胞的细胞周期分布,明确RMI1是否在DNA损伤应答过程中发挥作用。5.研究RMI1缺失对复制叉损伤时RAD51招募的影响。通过免疫荧光检测RMI1缺失细胞是否影响DSBs细胞中RAD51的招募。免疫荧光检测HU处理后RAD51和γH2AX同时阳性的细胞,评价RMI1对DNA损伤细胞中RAD51招募的影响。然后通过免疫荧光检测DNA复制应激时RMI1缺失细胞是否影响RPA32的水平,确定RMI1对复制应激时ssDNA的影响。研究结果:1.RMI1形成核聚集体应答复制应激。2.RMI1沉默细胞对HU的敏感性升高。3.RMI1沉默降低细胞DNA损伤的修复功能。4.RMI1沉默细胞对HU诱导复制应激的应答反应增强,细胞周期阻滞在G2/M期的细胞比例增多。5.RMI1沉默影响RAD51的募集到DSBs,增加了复制应激时ssDNA的积累。研究结论:本研究发现RMI1沉默细胞对HU敏感性升高。通过彗星实验表明,在HU诱导的复制应激RMI1沉默的细胞中损伤的DNA增加。此外RMI1缺失抑制RAD51招募到损伤的DNA位点上。并且复制应激时RMI1缺失过量激活细胞周期检验点和引起细胞周期阻滞。研究表明RMI1在应答复制应激时具有的重要作用,为RMI1在维持基因组稳定的分子机制提供基础。