一直以来,生物学家们都梦想拥有一种能够随意调控基因特异性表达的技术,CRISPR/Cas Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated system)系统的横空出世大大满足了这种需求,Cas9就像一把魔剪,在sgRNA的引领下,特异性地识别切割目的序列,并形成DNA的双链断裂缺口。近年来,一些科学家通过研究Cas9的结构,然后通过定点突变的方法使Cas9的核酸内切酶的活性失活而获得了dead Cas9(简写为dCas9),dCas只会在sgRNA的引导下特异性的结合到靶标,而不会对DNA产生切割。如果在dCas9上融合一些激活元件的话,就可以特异性地过表达目的基因,从而可以实现调控基因表达的梦想。这种方法相对于传统的过表达具有非常显著的优势;因为它可以不受基因大小的限制,可以非常方便同时上调多个基因表达,而且这种过表达会更加“nature”,可以研究复杂的多蛋白和多基因因素引起的人类疾病。现在由dCas9为基础的载体介导基因激活已经被广泛用于体外研究,但利用dCas9在体内控制特定的目的基因表达还一直没有得到实现。DNA甲基化是向DNA添加甲基的一个后生过程,主要发生在CpG(cytosine phosphodiester guanine)二核苷酸中胞嘧啶碱基的第五个碳上。甲基化可以改变DNA片段活性而不改变其序列。在哺乳动物细胞中,DNA的甲基化可以精密地调控基因的表达,从而在许多生理和病理过程中发挥着关键的作用,其中包括:细胞发育和分化、基因在特定时间的表达沉默、基因组印迹和肿瘤发生等等。因此,开发在体内调控靶基因DNA甲基化状态的技术,不仅有助于我们理解DNA甲基化如何在特定时间和空间下调节基因的表达,而且能主动的操纵基因表达,并可能在临床治疗上有着非常光明的前景。Ten-eleven translocation(Tet)加双氧酶催化的5-甲基胞嘧啶氧化,可促使具有Tet催化结构域(Tet-catalytic domain,Tet-CD)的DNA去甲基化。利用CRISPR-dCas9系统融合Tet-CD蛋白,靶向DNA去甲基化,是我们这个课题的出发点。在这项研究中,我们得到以下结论:(1)首先我们构建了All-in-one vector,它优化了基于dCas9的CRISPR系统,除了在dCas9蛋白后面融合了Tet-CD蛋白以外,还通过核糖体结合位点(IRES)连接了MS2-NLS-Tet-CD蛋白,从而可以更多的表达Tet-CD蛋白,以达到提高靶定DNA去甲基化的效率的目的。同时选取Makorin ring finger 3(Mkrn3)基因的启动子区域作为靶标,在Neuro-2a和胎鼠原代神经元细胞中进行转染dCas9-s gRNA-Tet1CD-IRES-MS2-NLS-Tet-CD质粒,使用使用QPCR技术检测Crispr-dCas9激活系统在Neuro-2a细胞和胎鼠原代神经元中激活M krn3基因的表达情况,我们发现Mkrn3基因表达得到了明显上调,相对于对照组大约增加了2倍。这为以后的实验提供了良好的技术支持。(2)我们进一步以慢病毒载体为基础构建了CRISPR-dCas9激活系统靶定Mkrn3 Promoter的去甲基化,使用QPCR技术检测激活Mkrn3基因的表达情况,我们发现实验组的Mkrn3基因的表达得到了明显的上调,相对于对照组大约增加了4倍。希望该慢病毒系统能够得到更广泛的应用。(3)最后以dCas9-VP64载体为基础构建的Crispr-dCas9激活系统靶定Mkrn3 Promoter去甲基化,使用QPCR技术检测激活Mkrn3基因的表达情况,我们可以得出该系统具有非常高的效率,大约为3倍。与我们之前以慢病毒载体为基础构建的Crispr-dCas9激活系统相比较发现,后者具有更高的效率,大约为4倍,但是都比以Crispr-dCas9载体为基础构建All-in-one vector的激活系统效率要高。我们分析发现可能是由于All-in-one vector载体多达15kb,导致质粒转染效率低的缘故,从而影响了Mkrn3基因表达的检测。未来还将换用腺相关病毒载体(AAV)进一步验证该系统去甲基化的效率,同时我们也将利用该系统融合甲基化酶DNMT3a和DNMT3L,检测该系统甲基化某些基因的效率。由于DNA甲基化与某些人类疾病间的关系紧密,尤其是在癌症中抑癌基因普遍存在被过度甲基化修饰而表达受到抑制或沉默的现象,因而引发肿瘤。如果能够利用我们构建的dCas9去甲基化系统,对多基因同时进行调控,将会加快疾病机理的阐明和药物靶点的开发的进程,也为未来的基因治疗提供潜在的治疗手段。综上所述,由我们开发的这套sgRNA介导的dCas9去甲基化系统未来会在表观遗传学编辑和临床研究中具有非常光明的应用前景。