目的：大肠癌目前仍是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，全世界最常见的恶性肿瘤中大肠癌位于第3位，大肠癌导致死亡的人数占所有恶性肿瘤死亡人数的10％。肠癌患者脾虚证的表现明显，一方面肠癌本身降低脾的运化和升清功能，另一方面手术及放化疗后，脾的运化和升清功能进一步下降，因此脾虚贯穿了肠癌发生和发展的全过程。控制肠癌进展、提高肠癌患者生活质量、提高免疫力应从脾论治。临床研究已经初步证明，在“益气健脾抗癌”原则下形成的方剂治疗消化系统肿瘤，具有抗癌、改善患者的症状、减轻放化疗毒性等作用。体外实验研究也证明，益气健脾抗癌中药具有促进大肠癌细胞凋亡及抑制凋亡相关基因表达的作用，但目前抗肿瘤机制的分子水平研究还不够深入。本实验研究旨在研究益气健脾抗癌法对肠癌脾虚本质的影响及抗肿瘤的机理，分析肠癌辨证论治规律；进一步证明中医益气健脾抗癌法的治疗作用，深入研究益气健脾和抗癌之间的内在关系，在细胞水平、分子水平、蛋白质水平层面深入揭示益气健脾抗癌法的作用机理，本实验具有较为重要的临床意义。材料与方法：1.肠癌HT-29细胞株体外培养：肠癌HT29细胞株常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基之中，在37℃，5％二氧化碳100%饱和湿度的培养箱中传代培养，次日观察细胞成活情况。肠癌细胞株HT29为贴壁生长细胞，细胞24小时即进入对数生长期，取对数生长期以上的贴壁细胞，消化后以新鲜培养液配制成1×104个/毫升，96孔板各孔加100μL，置37℃，5％二氧化碳100%饱和湿度的培养箱中培养。24小时后改为成无血清的培养基加受试血清，受试血清加入各孔内（10μL/孔），同一浓度的设3孔，对照孔中加10μL正常血清，调零孔中加100μL培养液。继续培养72小时后，每孔加100μL的5mg/mL的MTT溶液，置于培养箱内4小时后，每孔加100μL溶解液，培养箱内过夜，用全自动酶标仪测570nm处记OD值。取对数生长期的HT29细胞，调整成细胞浓度为5.0×104个细胞/毫升的悬浮液。2.人肠癌HT-29细胞移植瘤鼠建模：选择对数生长期肿瘤细胞，细胞浓度调至1×107/ml，裸鼠右腋下碘伏消毒，使用1ml注射器在裸鼠右腋下接种肿瘤细胞液0.2ml/只鼠，整个操作过程均要求无菌操作，每天观察肿瘤的生长情况。接种15天后，以在接种部位出现肿瘤结节直径达0.8cm，质地较硬等指标认定为成瘤。3.实验动物分组及给药：40只裸鼠按随机数字表法编号分为空白组、模型组、益气健脾组、益气健脾抗癌组。每组10只。空白组及模型组用生理盐水灌胃14天，益气健脾组和益气健脾抗癌组分别给予六君子汤和六君子汤合用抗癌药物，灌胃14天。给药量：根据人和鼠给药剂量换算公式计算各组给药的剂量。①空白组：0.2ml/只·d生理盐水灌胃②模型组：0.2ml/只·d生理盐水灌胃③益气健脾组：六君子汤33.3g/kg体重(相当于临床人用量的12倍)，0.2ml/只·d灌胃④益气健脾抗癌组：六君子汤加抗癌中药33.3g/kg体重(相当于临床人用量的12倍)，0.2ml/只·d灌胃。4.实验取材：实验结束，第14天，禁食18小时后，裸鼠灌胃给予营养性半固体糊0.8mL/只。20分钟后采用脱颈椎方法处死裸鼠，各组裸鼠分别进行取材，脱颈处死裸鼠置于冰盒上，完整剥离出瘤体，称重后置于冰盒上，肉眼观察瘤组织后，切取肿瘤全层组织，同时多点取材避免肿瘤坏死组织，共取材3份：（1）组织标本：取出胃、肠、脾、肝、肾，用滤纸擦干组织，直铺于白纸上，备用。（2）Western Bloting标本：组织块直接置于EP管中，-80℃冰箱中冻存备用；（3）用于TUNEL检测细胞凋亡及免疫组化检测，标本取材后，置于4%多聚甲醛固定液中4℃冷藏备用。5.检测指标：第一部分实验是益气健脾抗癌法对肠癌裸鼠脾虚本质及消化吸收功能影响的实验研究，测定的指标为：一般状态（食量、饮水量、体重）、采用羧甲基纤维素钠法测定胃排空率、小肠推进率。第二部分实验为益气健脾抗癌法对肠癌裸鼠脾、肝、肾脏器系数及脾、肝、肾脏PKC活性影响的实验研究，观察脾虚证免疫功能指标，测定的指标为：脾、肝、肾脏系数、采用Western blot法测定脾、肝、肾脏PKC蛋白表达。第三部分实验为益气健脾抗癌法抑制肠癌裸鼠肿瘤生长及对EGF、VEGF表达影响的实验研究，观察对肠癌裸鼠肿瘤生长、细胞凋亡及瘤体EGF、VEGF表达的影响，测定指标：瘤重、抑瘤率、并用TUNEL法测定瘤体细胞凋亡、采用Western-blot法测定瘤体EGF、VEGF表达。结果：1.一般状态：给药10天后模型组，益气健脾组和益气健脾抗癌组的荷瘤裸鼠表现为较以前消瘦，精神萎靡不振、活动次数减少、皮肤色泽晦暗无光泽，摄食、摄水减少，但以模型组明显，而益气健脾抗癌组荷瘤裸鼠的状态保持较好。空白组食量及饮水量最多，明显多于其他三组（p＜0.05），尤其与模型组对比差别更加明显；在与模型组对比发现，益气健脾组与益气健脾抗癌组均好于模型组（p＜0.05），而益气健脾组与益气健脾抗癌组对比则无统计学意义，但后者有好于前者趋势；各组裸鼠体重变化情况：给药前各组裸鼠体重无显著性差异（P=0.782）。给药后一周除了空白组体重持续上升外，其余各组裸鼠体重出现不同程度下降，模型组下降最多，益气健脾抗癌组下降幅度明显低于模型组及益气健脾组（P﹤0.05），但是益气健脾抗癌组与益气健脾组比较无显著差异(P>0.05)；直至实验第14天，实验结束时各组体重：模型组最轻，空白组最重，空白组（6.33±2.4）明显高于益气健脾组（4.78±2.9）、模型组（2.48±2.1）及益气健脾抗癌组（5.03±3.2），差异具有统计学意义（P<0.05）。益气健脾抗癌组与益气健脾组体重降低，差异无统计学意义，但均优于模型组（P<0.05）。2.胃内残留率及小肠推进率：空白组胃内残留率为29.4±13.2%及小肠推进率为68.4±9.4%，在各组中为最好，表现为胃内残留率最小，小肠推进率最大，与其他三组比较有明显差别（p＜0.05），但益气健脾抗癌组与之差别最小。模型组胃内残留率为47.5±12.3%及小肠推进率为49.3±10.2%，在各组中为最差，其他三组与之比较有明显差别（p＜0.05）。益气健脾组胃内残留率为35.7±14.1%、小肠推进率为62.5±11.3%，益气健脾抗癌组胃内残留率为40.2±12.5%、小肠推进率为58.7±10.6%，给药2组间无统计学差异，但益气健脾抗癌组有好于益气健脾组的趋势。3.脏器系数：与空白组比较，模型组脾、肝、肾脏系数明显下降（p＜0.05）；给药后，益气健脾组与益气健脾抗癌组脾、肝、肾脏系数较模型组均上升（p＜0.05），其升高程度益气健脾抗癌组与益气健脾组无统计学意义（p＞0.05），但后者有好于前者趋势。4.脏器中PKC活性表达：与空白组比较模型组裸鼠免疫器官脾脏中PKC活性表达明显降低（p＜0.01）；给药后，益气健脾组和益气健脾抗癌组裸鼠脾脏中PKC活性较模型组均上升（p＜0.05），其中益气健脾抗癌组较益气健脾组上升更为显著（p＜0.05）；与空白组比较模型组裸鼠肝、肾脏中PKC明显升高（p＜0.05）；给药后，益气健脾组和益气健脾抗癌组裸鼠肝、肾脏中PKC活性较模型组均下降（p＜0.05），其中益气健脾抗癌组PKC活性下降较益气健脾组下降更为显著（p＜0.05）。5.瘤重、抑瘤率：瘤重方面模型组、益气健脾组、益气健脾抗癌组为分别为3.94±0.81g、3.01±0.45g、2.43±0.36g，治疗后的两组肿瘤生长明显小于模型组，分析有统计学意义（p＜0.05）；益气健脾抗癌组的瘤重有小于益气健脾组，对比有统计学意义（p＜0.05）。抑瘤率方面，益气健脾组和益气健脾抗癌组分别为24%、38%，两组对比差别明显，有统计学意义（p＜0.05）。6.细胞凋亡数检测：益气健脾组、益气健脾抗癌组和模型组差别明显，分别为3.5±1.08、8.70±1.34、0.80±0.70个，益气健脾组、益气健脾抗癌组和模型组差别明显，结果有统计学意义（p＜0.01）。益气健脾组与益气健脾抗癌组对比，后者的凋亡细胞明显多于前者，二者差别有统计学意义（p＜0.01）。7.肿瘤EGF、VEGF检测结果：模型组、益气健脾组、益气健脾抗癌组检测结果分别为：0.574±0.020、0.596±0.014，0.506±0.023、0.533±0.016，0.368±0.021、0.419±0.012，模型组中EGF、VEGF表达最高，益气健脾组表达较之略低，但无统计学意义；益气健脾抗癌组中EGF、VEGF表达明显低于前两者，结果有统计学意义（p＜0.05）。模型组高于益气健脾组、益气健脾抗癌组（P＜0.01），益气健脾抗癌组高于益气健脾组（P＜0.01）。结论：1.肠恶性肿瘤可导致脾虚证，对脾胃消化吸收功能的影响显著；益气健脾方药可以改善荷瘤裸鼠一般状态，减轻肠癌脾虚引起的体重下降；益气健脾方药可以增强胃肠动力，改善脾胃运化功能。2．细胞水平层面分析肠癌瘤鼠致脾虚现象的客观存在性，肠癌能抑制脾、肝、肾脏本身的生长；益气健脾抗癌法可改善实验性肠癌裸鼠脾功能，其机制是通过提高脾脏重量和脾脏系数，增强脾PKC活性表达而实现的；益气健脾抗癌方药对大肠癌脾虚证裸鼠各组织PKC活性表达有明显影响作用，可能是其作用机制之一。3.益气健脾与益气健脾抗癌组对HT-29人肠癌裸鼠移植瘤有明显抑制作用，但后者抗癌效果好于前者；其抑制肿瘤生长的作用机制可能是通过诱导细胞凋亡及下调肿瘤表皮生长因子EGF、血管内皮生长因子VEGF的表达实现的。这将为益气健脾抗癌法应用于肠癌的综合治疗提供了实验室依据。