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前言精液冷冻保存是辅助生殖(assisted reproductive techniques,ART)领域中的一项重要技术,是保存男性生育力的一种重要方式,广泛应用于可能会导致睾丸衰竭或者射精机能障碍的放、化疗以及手术治疗之前。但是精子冷冻保存的最大缺陷就是解冻后的精子质量不满意,包括活率、活力以及精子DNA完整性的降低,在不育患者中这种状况尤为突出。目前关于冷冻导致精子DNA损伤的病因尚未完全阐明,其中,冷冻过程诱发氧化应激和过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成被认为起到了主要的作用。氧化应激可导致多种形式的DNA损伤,例如:染色质交联、染色体缺失、碱基氧化、DNA链损伤等。由于H2O2具有较强的氧化活性,并且可以和O2反应持续产生(O2·-)和羟自由基(·OH);另外H2O2来源方便,所以我们的前期实验用不同浓度H2O2作为精子氧化应激性DNA损伤试剂,探索H2O2精子DNA损伤模型,以研究冷冻精子DNA损伤修复反应机制。在真核生物中,DNA损伤激活DNA损伤修复与检查点系统,共同监视DNA损伤,控制DNA的修复、细胞周期进程以及程序化细胞死亡。为了维持基因组的完整性及细胞分裂过程中完全复制的和未损伤的DNA的正确转导,有丝分裂前,真核生物细胞经历了G1/S,intra-S,G2/M细胞周期检查点。检查点信号通路激活后可以短暂性的停止或放慢细胞周期过程,要么为细胞DNA损伤修复所涉及的基因转录的增强及其产物的活动提供足够的时间,要么为引发凋亡过程提供足够的时间。精子缺乏损伤修复系统,但是DNA损伤精子仍然具有受精能力和发育潜能,损伤要在受精后修复。目前胚胎发育过程中损伤修复系统以及细胞周期检查点系统的研究不多,确切作用机制尚不清楚。本实验运用合理的DNA冷冻损伤精子模型,研究氧化应激性DNA损伤精子体外受精(in vitro fertilization,IVF)后早期胚胎的发育,探讨精子的氧化应激性DNA损伤是否激活了受精卵内的细胞周期检查点信号通路来引发有丝分裂细胞周期的阻滞或延迟,以初步探索DNA损伤精子受精后早期胚胎的损伤反应机制。目的1.研究氧化应激性DNA损伤精子体外受精后早期胚胎发育情况。2.验证氧化应激性DNA损伤精子体外受精后早期胚胎内细胞周期检查点信号通路的激活。方法1.倒置显微镜下观察新鲜精子组和H2O2处理精子组体外受精的受精率,1-细胞胚胎和2-细胞胚胎的卵裂率以及发育情况。2. BrdU掺入法检测新鲜精子组和H2O2处理的精子组体外受精后受精卵S期(DNA合成)开始和持续时间。观察受精卵排出第二极体的时间来评估受精卵第一次有丝分裂G1期开始的时间。结合受精卵完成第一次卵裂(即M期)结束的时间,求出G1、G2/M期,比较新鲜精子组和H2O2处理的精子组体外受精后一细胞胚胎细胞周期各时相(G1、S、G2/M)经历的时间,验证G1、intra-S或G2/M细胞周期检查点的激活。结果1.新鲜精子组和1.0mM H2O2处理精子组的受精率分别为71.4±16.1%和62.6±12.3%,差别无统计学意义(P>0.05)。受精后第24小时观察1-细胞胚胎卵裂率分别为98.3±0.5%和97.2±1.6%,差别无统计学意义(P>0.05)。受精后第48小时观察2-细胞胚胎卵裂率分别为95.3±0.7%和87.3±6.5%,差别无统计学意义(P>0.05)。新鲜精子组1-细胞胚胎卵裂率≥95%时为精卵结合后20±0.9小时,H2O2处理精子组1-细胞胚胎卵裂率≥95%时为精卵结合后22.5±1.1小时,差别有统计学意义(P<0.05),因此H2O2处理精子组1-细胞卵裂延迟时间平均约2.5个小时。新鲜精子组2-细胞胚胎卵裂率≥95%时为精卵结合后48.8±1.5小时,H2O2处理精子组2-细胞胚胎卵裂率≥95%时为精卵结合后51±2.7小时,差别无统计学意义(P>0.05)。因此与新鲜精子组相比,H2O2处理精子组1-细胞期胚胎发生了卵裂延迟,2-细胞期胚胎的卵裂速度基本达到了正常胚胎水平。2.新鲜精子组和1.0mM H2O2处理精子组G1期开始的时间分别为精卵结合后1.8±1.0小时和1.7±1.1小时,差别无统计学意义(P>0.05)。S期开始的时间分别为精卵结合后9.8±0.6小时和10.3±1.0小时,差别无统计学意义(P>0.05),S期结束的时间分别为精卵结合后17.0±0.8小时和17.7±0.6小时,差别无统计学意义(P>0.05)。因此,新鲜精子组S期的平均持续时间约为7.2小时,1.0mM H2O2处理精子组S期的平均持续时间约为7.4小时;新鲜精子组G1期平均持续时间约8小时,1.0mM H2O2处理精子组G1期平均持续时间约8.6小时,新鲜精子组G2/M期平均持续时间约3小时,1.0mM H2O2处理精子组G2/M期平均持续时间约4.8小时,因此1.0mM H2O2处理精子组体外受精后一细胞胚胎G2/M期延迟平均约1.8小时。结论1.氧化应激性DNA损伤精子体外受精后受精能力以及1-细胞和2-细胞胚胎的发育能力不变,受精卵第一次有丝分裂细胞周期延迟,第二次卵裂时间与正常胚胎细胞卵裂时间相当。2.氧化应激性DNA损伤精子体外受精后胚胎细胞在第一次有丝分裂细胞周期启动了G2/M检查点。