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研究背景和目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种严重危害人类健康的慢性炎症性疾病,其发病率和死亡率呈明显上升趋势,尽管AS形成过程非常复杂,但目前普遍认为从内皮细胞损伤、AS斑块的破裂到血栓形成,炎症反应贯穿了 AS发生发展的全部阶段。血管壁在AS早期表现为急性渗出性炎症,在AS进展期表现为慢性增生性炎症。既往的研究证明,促炎因子白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和核转录因子-kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB)在AS的发生发展及其转归中发挥关键作用。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,是细菌死亡溶解后,从细菌胞壁中释放出来的重要免疫调节分子,所以又称内毒素(Endotoxin)。吸收外源性脂多糖导致血管内皮细胞损伤,引起促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和核转录因子NF-κB的表达升高,从而诱导机体的炎症反应。尽管众多研究表明LPS可诱导IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表达,但其具体机制仍不清楚,还有待进一步研究。干扰素刺激基因(IFN stimulated genes,ISGs)共有 4 个成员:IFIT1/ISG56,IFIT2/ISG54,IFIT3/ISG60 和 IFIT5/ISG5,其中 ISG56 又称为 IFIT1(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)基因,人类 IFIT1 基因定位于10q23.31,IFIT1诱导蛋白为胞浆蛋白,正常生理状态时,绝大多数细胞不表达IFIT1,但干扰素、病毒感染或LPS可以诱导其转录。研究发现IFIT1 mRNA水平在M1极化的巨噬细胞中明显上调,IFIT1在AS小鼠主动脉窦和头臂动脉切片的巨噬细胞亚群中高表达,说明IFIT1可能与炎症反应有关。但是IFIT1是否参与内皮细胞炎症反应,及其相关机制仍需要进一步探索。研究材料与方法:1.LPS对人脐静脉内皮细胞IFIT1的影响使用0,250,500,1000ng/mL四个浓度梯度的LPS处理人脐静脉内皮细胞,24h后,提取mRNA和总蛋白,分别用实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)和 western blotting(WB)检测IFIT1 mRNA和蛋白的表达水平。此外,为研究LPS处理人脐静脉内皮细胞不同时间对IFIT1表达的影响,分别使用1000ng/mL的LPS处理内皮细胞0,6,12,24h后,提取mRNA和总蛋白,采用qRT-PCR和WB检测IFIT1的mRNA和蛋白表达水平。2.构建IFIT1过表达的人脐静脉内皮细胞模型构建过表达IFIT1的质粒以及阴性对照质粒载体,转染人脐静脉内皮细胞后,分别通过qRT-PCR技术和WB检测IFIT1的表达情况,验证IFIT1过表达效率;加或不加LPS处理24h后,用qRT-PCR和WB检测IFIT1、IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。3.构建IFIT1敲减的人脐静脉内皮细胞模型构建特异靶向IFIT1的siRNA以及阴性对照siRNA载体,转染人脐静脉内皮细胞后,分别通过qRT-PCR技术和WB检测IFIT1的表达情况,验证IFIT1干扰效率;加或不加LPS处理24h后,用qRT-PCR和WB检测IFIT1、IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.使用0,250,500,1000ng/mL四个浓度梯度的LPS处理人脐静脉内皮细胞24h后,通过qRT-PCR和western blotting检测IFIT1的mRNA和蛋白表达水平,结果发现LPS可浓度依赖性上调IFIT1的表达,且1000ng/mL时效果较明显。此外,用1000ng/mL的LPS分别处理人脐静脉内皮细胞0,6,12,24h后,通过qRT-PCR和WB检测IFIT1的mRNA和蛋白表达水平,结果发现LPS可呈时间依赖性上调人脐静脉内皮细胞中IFIT1 mRNA和蛋白的表达水平。2.对转染IFIT1过表达的质粒以及阴性对照质粒载体的人脐静脉内皮细胞中IFIT1的表达量进行qRT-PCR和WB检测,结果发现转染IFIT1过表达质粒载体的人脐静脉内皮细胞中IFIT1的表达量明显高于对照细胞株(P<0.05);使用LPS处理已成功构建的过表达IFIT1的人脐静脉内皮细胞模型,通过qRT-PCR 和 WB 检测 IFIT1、IL-1β、IL-6、TNF-α 和 NF-κB 的 mRNA 和蛋白表达水平,结果发现过表达IFIT1可上调IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白的表达水平,且发现LPS处理过表达IFIT1的人脐静脉内皮细胞模型可进一步上调上述炎性因子和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。3.对转染IFIT1小干扰RNA载体以及阴性对照载体的人脐静脉内皮细胞中IFIT1的表达量进行qRT-PCR和WB检测,结果发现干扰细胞株中IFIT1的表达量明显低于对照细胞株(P<0.05),表明敲减IFIT1的人脐静脉内皮细胞模型已成功构建。使用LPS处理已成功构建的敲减IFIT1的人脐静脉内皮细胞模型,通过qRT-PCR和WB检测IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平,结果发现敲减IFIT1可下调IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白的表达水平,且可抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的高表达。结论:IFIT1在动脉粥样斑块组织中的表达明显升高;LPS可以上调IFIT1的表达,并诱导人脐静脉内皮细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表达;IFIT1通过上调IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的水平调节细胞的炎症反应,进而促进AS的发生发展。因此,针对IFIT1的干预措施可能有助于减轻与AS相关的炎症反应。