论文部分内容阅读
目的医疗诊断和治疗中电离辐射应用增多,核能生产、太空活动增加,给人类带来巨大的利益与帮助。同时,人类对电离辐射暴露机会增多,可能对人类健康产生损害。机体的造血系统对辐射最为敏感,短期的高剂量辐射暴露和长期的低剂量辐射暴露均能引起造血系统损伤,电离辐射对造血系统的损伤主要表现为:急性骨髓抑制和长期骨髓抑制。急性骨髓抑制主要是由于造血祖细胞(Hematopoieticprogenitor cells,HPCs)和少量造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)的凋亡,临床上利用造血细胞生长因子(Hematopoietic growth factors,HGFs)治疗缓解症状;长期骨髓抑制主要由于HSCs衰老,HSCs自我更新能力降低,导致骨髓衰竭,目前尚无有效治疗手段,死亡率较高。由此,造血细胞辐射损伤防护与治疗方法的研究一直是人们关注的热点。辐射诱导的氧化应激是造血细胞辐射损伤的重要机制,辐射诱导的氧化应激可以促进造血细胞凋亡,诱导HSCs衰老、分化异常,导致其数量减少,自我更新能力下降,最终导致骨髓抑制,骨髓衰竭。生理情况下,机体细胞存在有效的活性氧(Reactive oxyen species,ROS)清除机制,叉头状转录因子O亚族 3(Forkhead box transcription factor O 3,FOXO3/FOXO3A)在氧化应激调节上发挥重要作用,ROS可以诱导FOXO3A转录激活,促进抗氧化酶系基因的表达上调,清除ROS,减轻氧化应激损伤。前期有研究发现FOXO3A转录因子在造血干细胞稳态调节上发挥重要作用。进一步研究FOXO3A在造血细胞辐射损伤中的作用及作用机制将会为造血系统辐射损伤的诊断治疗提供资料。本研究拟利用FOXO3A基因敲除小鼠探究FOXO3A在造血细胞辐射损伤中的作用,同时对相应的机制进行探讨。方法引进FOXO3A基因敲除小鼠(FVB/N和C57BL/6J),在SPF级实验动物房进行饲养和繁殖,通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法鉴定选育出FOXO3A基因敲除纯合型小鼠(FOXO3A-/-)和野生型小鼠(FOXO3A+/+,WT)用于后续实验。后续体外、体内实验使用FVB/N背景的FOXO3A-/-和WT小鼠进行。体外实验,分离FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠未分化骨髓细胞(Lineage negative bone marrow cells,Lin-BMCs),分别接受 1 Gy、4Gy X-线照射(剂量率为 0.9Gy/min)和假照射,照射后分别测定细胞活力、粒细胞-巨噬细胞集落形成能力(Colony forming unit-granulocyte and macrophage,CFU-GM)及 HSCs 和 HPCs 中磷酸化组蛋白 H2AX(Phosphorylated Histone H2AX,γH2AX)表达,观察 FOXO3A 基因敲除对未分化骨髓细胞辐射敏感性的影响及对造血干细胞和造血祖细胞辐射损伤的景影响。体内实验,将FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠分为野生型小鼠对照组(WT组),FOXO3A-/-小鼠对照组(FOXO3A-/-组),野生型小鼠照射组(WT+IR),FOXO3A-/-小鼠照射组(FOXO3A-/-+IR)四组,分别接受假照射和4Gy X-线全身照射(Totalbody irradiation,TBI),剂量率为0.9Gy/min。接受TBI后14天检测FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠脏器指数、外周血和骨髓细胞计数,骨髓细胞分型,HPCs集落形成能力,观察FOXO3A基因敲除对造血细胞辐射敏感性和造血系统辐射损伤恢复的影响。结果FVB/N和C57BL/6J品系SPF级FOXO3A基因敲除小鼠成功饲养繁育,建立有效可靠的PCR检测方法,鉴定FOXO3A基因敲除小鼠基因型。子代FOXO3A-/-小鼠与杂合型(FOXO3A+/-)小鼠生长良好,与野生型小鼠相比外观、生长发育均未见明显差异。生理情况下,FVB/N品系FOXO3A-/-小鼠与WT小鼠Lin-BMCs相比,细胞活力下降,CFU-GM下降,γH2AX表达下降,差异具有显著性(P<0.05)。同时FOXO3A-/-小鼠骨髓有核细胞计数下降,HPCs 比例升高,差异具有显著性(P<0.05)。POXO3A-/-小鼠的外周血计数,体重及脏器指数与WT小鼠相比未见明显差异(P>0.05)。小鼠Lin-BMCs在分别接受1Gy、4Gy的X-线照射后,FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠Lin-BMCs均出现细胞活力下降,呈剂量效应关系,时间效应关系;进一步分析发现,在接受1Gy X-线照射后6h,FOXO3A-/-小鼠Lin-BMCs活力下降率低于WT小鼠,差异有显著性(P<0.001);在接受4Gy X-线照射后12h,FOXO3A-/-小鼠Lin-BMCs活力下降率低于WT小鼠,差异有显著性(P<0.05)。体外CFU-GM实验显示:1Gy、4Gy的电离辐射均可以明显降低FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠的Lin-BMCs的CFU-GM(P<0.05),呈剂量效应关系;但是两种小鼠Lin-BMCs细胞损伤程度未见明显差异(P>0.05)。体外DNA损伤检测结果显示,接受X-线照射后,FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠HSCs、HPCsγH2AX表达率均出现增加,呈剂量效应关系;进一步分析发现,接受1GyX-线照射后,FOXO3A-/-小鼠骨髓HPCsγH2AX表达增加率高于WT小鼠,差异有显著性(P<0.001);接受4Gy X-线照射后,FOXO3A-/-小鼠骨髓HSCs和HPCs γH2AX表达增加率均高于WT小鼠,差异有显著性(P<0.01)。小鼠在接受4Gy X-线TBI后2周发现,4Gy X-线TBI可以引起FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠外周血细胞计数降低、骨髓细胞计数和脾脏指数下降以及HPCs、HSCs比例和数目降低,差异具有显著性(P<0.05)。接受4Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠骨髓有核细胞数下降率显著低于WT小鼠;接受4Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠CFU-GM数高于WT小鼠,差异具有显著性(P<0.001)。而接受4Gy TBI的FOXO3AA-/-小鼠HSCs及HPCs 比例降低程度显著高于WT小鼠(P<0.05)。但是接受4Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠间白细胞数、红细胞数、血红蛋白含量、血小板计数、淋巴细胞和中性粒细胞比例均未见明显差异(P>0.05);脾脏指数下降幅度上也未见明显差异(P>0.05)。结论我们的实验结果表明:1)生理情况下,FOXO3A基因敲除会破坏造血系统稳态维持,导致造血细胞损伤性改变。2)FVB/N品系小鼠Lin-BMCs接受1Gy、4Gy X-线照射,FOXO3A基因敲除加重造血细胞DNA损伤。3)小鼠接受4Gy X-线全身照射,FOXO3A基因敲除会加重电离辐射诱导的HPCs和HSCs比例下降,加重造血干/祖细胞损伤,但对辐射诱导的骨髓有核细胞数下降及造血祖细胞克隆形成能力下降有明显抑制作用,提示FOXO3A基因敲除破坏造血细胞稳态维持,在电离辐射诱导下表现出应激反应性的差异。综上表明,FOXO3A基因敲除会加重HPCs和HSCs的辐射损伤,对造血细胞的稳态维持及辐射敏感性产生一定的影响。FOXO3A在造血系统电离辐射损伤中的调节作用以及能否作为防治损伤的靶点还有待进一步研究。