论文部分内容阅读
目的:通过研究加味独活寄生合剂含药血清对兔正常关节软骨细胞、退变的软骨细胞模型及骨髓间充质干细胞成软骨诱导细胞的增殖及凋亡的影响,从Wnt信号通路角度,初步阐明加味独活寄生合剂保护兔关节软骨的作用机制。方法:采用高效液相色谱-四级杆-时间飞行质谱仪(UPLC-Q-TOF)分析加味独活寄生合剂和含药血清的主要成分;体外细胞培养技术分离培养软骨细胞及间充质干细胞;流式细胞技术检测细胞周期及凋亡情况、MTT法检测细胞活性及药物细胞毒性、Tunel法检测细胞凋亡情况、Western-Blot法、Real time-PCR法及免疫组化法检测Wnt信号通路相关的基因和蛋白的表达。结果:(1)加味独活寄生合剂UPLC-Q-TOF分析确认了47个共有峰,通过分析比对主要包括亚麻酸甲酯、腺苷、邻苯二甲酸二异丁酯等47个化合物,主要是加味独活寄生合剂处方中的:独活、桑寄生、杜仲等18味药物成分,当前的条件分析尚未检测到细辛的药物成分。(2)加味独活寄生合剂含药血清UPLC-Q-TOF分析指认33个共有峰,通过分析比对主要包括邻苯二甲酸二异丁酯、金合欢基丙酮、十二酸甘油酯等33个化合物,主要是加味独活寄生合剂处方中的:独活、桑寄生、杜仲等15味药物成分。当前的条件分析尚未检测到细辛、肉桂、秦艽、当归四味药物成分。(3)体外新西兰大白兔膝关节软骨组织的分离、培养及鉴定结果显示:第3代软骨细胞和骨髓间充质干细胞生长旺盛,细胞活力最强,为实验的最佳阶段;甲苯胺蓝染色结果显示其细胞核染成蓝色,胞浆及细胞间质可见紫红色染色。II型胶原免疫荧光法鉴定结果显示:软骨细胞胞浆被染成棕黄色,胞核不着色。MTT法检测不同浓度的加味独活寄生合剂干预24小时后细胞后活性,中浓度的加味独活寄生合剂,细胞的OD值最大,说明细胞的活性最大;不同加味独活寄生合剂组细胞的增殖和对照组相比,有统计学意义(P<0.05)。(4)流式细胞仪检测各组正常软骨细胞结果显示:各组干预12h、24h、48后,Wnt信号通路阻断剂组与空白血清组相比,G1期细胞数明显增多,G2期减少,S期减少。Wnt信号通路阻滞剂组和药物组相比,G1期明显增多,G2期减少,S期减少,PI低于药物组同期(P<0.05)。12h、24h、48h药物组和空白血清组相比,G1期、G2期和S期差异无统计学意义(P>0.05),但从趋势看随着时间的延长不同药物组的细胞凋亡较空白血清组减慢。(5)Western Blot法检测结果显示:低剂量组、中剂量组、高剂量组、Wnt通路阻断剂与空白血清组比较Wnt5a、β-catenin蛋白的表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。各组细胞SOX9蛋白均表达,不同剂量的加味独活寄生合剂含药血清组和与阻断剂组都高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);加味独活寄生合剂组,SOX9蛋白的表达浓度依赖性地升高。Aggrecan和Collagese type II蛋白表达的变化趋势和SOX9蛋白一致。RT-PCR法检测结果和免疫组化检测结果与Western Blot法检测结果相一致。(6)Tunel法检测细胞凋亡结果显示:模型组细胞凋亡最多;低、中、高加味独活寄生合剂含药血清和Wnt阻断剂组与模型组相比明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),其中含药血清组细胞凋亡随着药物浓度的升高而降低。(7)流式细胞仪检测IL-1β诱导的退变细胞周期结果显示:模型组与正常组相比,Wnt阻断剂组G1期细胞数增多,S期细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组相比,高剂量组G1期细胞数增多,S期细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(8)Western Blot法检测结果显示:模型组Wnt5a和β-catenin蛋白表达有显著升高。低、中、高剂量组与与模型组比较有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。其降低程度为呈浓度依赖性,高剂量组>中剂量组>低剂量组。模型组比正常组SOX9、Aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白表达显著升高(P<0.05);加味独活寄生合剂干预组(退变软骨细胞)和模型组相比,SOX9、Aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白表达浓度依赖性地升高,差异有统计学意义(P<0.05);Wnt阻断剂组和模型组相比,SOX9、Aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白表达显著升高(P<0.05)。RT-PCR法检测结果和免疫组化检测结果与Western Blot法检测结果相一致。(9)流式细胞仪检测各组MSC成软骨细胞结果显示:各组干预24h后各组细胞周期,Wnt阻断剂组与空白血清组相比,G1期细胞数明显增多,G2期减少,S期减少。Wnt阻滞剂组和药物组相比,G1期明显增多,G2期减少,S期减少,PI低于药物组同期(P<0.05)。(10)RT-PCR法检测各组MSC成软骨细胞结果显示:低剂量组、中剂量组、高剂量组、Wnt通路阻断剂与空白血清组比较Wnt5a、β-catenin mRNA的表达明显增高,且比较有统计学意义(P<0.05),β-catenin的表达变化趋势和Wnt5a相一致。各组细胞SOX9 mRNA表达,不同剂量的加味独活寄生合剂含药血清组和与Wnt阻断剂组都高于正常组,差异显著(P<0.05);加味独活寄生合剂组,SOX9 mRNA的表达浓度依赖性地升高。Aggrecan和Collagese type II mRNA表达的变化趋势和SOX9蛋白一致。各组细胞Casp3、Casp8、Bcl2、BAX mRNA均有表达,不同剂量的加味独活寄生合剂含药血清组与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)与Wnt阻断组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化检测各组MSC成软骨诱导细胞结果与RT-PCR法检测结果一致。结论:(1)加味独活寄生合剂体内直接作用物质很可能出自血清中的33个药源性成分,结合血清药理学对其作进一步研究有助于阐明该制剂药效物质基础。(2)加味独活寄生合剂含药血清能促进兔正常软骨细胞及骨髓间充质干细胞成软骨诱导细胞的增殖,其作用机制可能通过影响Wnt信号通路中的Wnt5a、β-catenin、SOX9、Aggrecan、Collagese II、Casp3/8、Bcl2、BAX等基因的表达,调控Wnt信号通路,进而调节细胞周期的G1期,促进正常软骨细胞的增殖。(3)加味独活寄生合剂含药血清能促进兔退变的软骨细胞凋亡,其作用机制可能通过影响Wnt信号通路中的Wnt5a、β-catenin、SOX9、Aggrecan、Collagese II、Casp3/8、Bcl2、BAX等基因的表达,调控Wnt信号通路,从而促进退变的软骨细胞凋亡,结合加味独活寄生合剂临床治疗KOA患者,其作用机制与中医“瘀去新生”理论相符合。