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第一部分HBV病毒表达活性与亚型鉴定目的:对HepG2.2.15细胞乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)亚型进行鉴定及评估细胞活性,以评价该细胞是否可作为本实验的良好细胞模型。方法:收集生长对数期的HepG2.2.15细胞,以0.25、0.5、1.0、2.0和4.0×10~5个/m L的细胞接种密度培养于6孔板中,每隔48h收集细胞培养上清液至无菌EP管中保存,共收集5次,分别采用荧光定量PCR技术和化学发光免疫技术测量HBV-DNA和HBs Ag的含量表达以对该细胞的亚型进行鉴定;采用高通量基因测序技术鉴定HBV亚型,并通过制备细胞爬片后用细胞免疫组化法检测细胞内HBs Ag、HBe Ag的表达情况以对HepG2.2.15细胞的活性进行鉴定,最后通过活性及亚型鉴定结果分析该细胞分泌HBs Ag和HBV-DNA的规律。结果:该细胞培养浓度为1.0×10~5个/m L细胞状态最佳、增殖最快。电泳检测出的条带与目的条带HBV S、C一致,基因测序病毒核酸序列与ayw血清型的S、C片段序列比对符合率大于99%,为ayw型,病毒活性结果显示HBs Ag、HBe Ag在HepG2.2.15细胞内均呈阳性,具有良好的表达活性。结论:HepG2.2.15细胞活性表达良好,可作为体外HBV相关研究的良好模型。第二部分HBV preS1/preS2编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定目的:针对HBV preS1/preS2区编码链设计反基因锁核酸(locked nucleic acid,LNA)片段,选出能够特异性阻断细胞内HBV复制与表达的片段。方法:针对HBV preS1/preS2编码链,利用RNA structure 6.0软件对3023~3037nt、3094~3109nt、3201~3215nt、3305~3320nt位点设计并合成4条(分别以SQ1-4表示)反基因LNA片段,以阳离子脂质体lipofectamine 3000(lipo3000)介导转染HepG2.2.15细胞,转染后的第3、6、9d收集培养上清液,实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)测定HBV-DNA浓度,化学发光免疫技术实验检测HBs Ag水平,最终通过实验结果进行LNA药物/lipo3000最佳比例的筛选,并对比组合的药物浓度与单独的药物浓度是否有差别。结果:针对HBV preS1编码链的3023~3037nt位点(SQ1)和preS2编码链的3305~3320nt位点(SQ4)的反基因LNA片段对HBs Ag表达和HBV-DNA复制抑制效果最为明显,转染后第3、6、9d,SQ1对HBs Ag的平均抑制率分别为36.17%,49.62%和61.94%,HBV-DNA分别为26.96%,38.31%,56.08%,SQ4对HBs Ag的平均抑制率分别为50.38%,57.42%,72.93%,HBV-DNA分别为48.68%,52.96%,61.79%。其中,SQ1按照LNA药物/lipo3000比例为1μg/1.5μL时抑制效果最明显,用药后第3、6、9d,SQ4按照LNA药物/lipo3000比例2μg/3μL时抑制效果最明显。通过组合药物实验的对比,HBV preS1编码链的3023~3037nt位点(SQ1)和preS2编码链的3305~3320nt位点(SQ4)联合用药能够进一步提升抑制效果。结论:针对HBV preS1编码链的3023~3037nt位点(SQ1)和preS2编码链的3305~3320nt位点(SQ4)的反基因LNA片段对HBs Ag表达和HBV-DNA复制抑制效果最为明显。3023~3037nt位点(SQ1)反基因LNA药物与lipo3000最适比例为1μg/1.5μL,3305~3320nt位点(SQ4)为2μg/3μL。针对HBV preS1编码链的3023~3037nt位点(SQ1)和preS2编码链的3305~3320nt位点(SQ4)联合用药能够进一步提升用药效果。第三部分HBV preS1/preS2编码链反基因锁核酸体外抗HBV效果目的:探讨HBV preS1 SQ1/preS2 SQ4编码链反基因LNA体外抗HBV效果。方法:利用RNA structure 6.0软件针对HBV preS1编码链3023~3037nt(SQ1)、preS2编码链3305~3320nt位点(SQ4)设计并合成反基因LNA片段。实验分别设空白对照组、无关序列对照组(USQ)、恩替卡韦(ETV)对照组、SQ1组、SQ4实验组和SQ1/SQ4实验组,以lipo3000脂质体介导HepG2.2.15细胞转染,收集转染后第2、4、6、8、10d的培养上清液,分别采用化学免疫发光技术和实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测HBs Ag和HBV-DNA含量,逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测细胞内HBV preS1 SQ1/preS2 SQ4 m RNA表达。最后采用cck8法检测反基因LNA对HepG2.2.15细胞基本代谢和凋亡的影响。结果:反基因LNA片段有较强的抗核酸酶降解能力;针对HBV pre1/pre2编码链的SQ1和SQ4能够有效抑制HBV复制,SQ1组给药后第2、4、6、8、10d的平均抑制率分别为34.53%、33.06%、35.12%、49.71%、51.42%,SQ4组给药后平均抑制率分别为36.37%、38.05%、48.34%、55.12%、58.29%,SQ1/SQ4组给药后平均抑制率分别为47.08%、60.60%、49.50%、61.36%、61.56%,SQ1组和SQ4组以及SQ1/SQ4组与ETV组比较,P<0.001。实验结果显示,空白对照组、无关序列组、ETV组、SQ1组、SQ4组、SQ1/SQ4组m RNA的相对表达量分别为0.996±0.013、0.983±0.019、0.732±0.021、0.621±0.021、0.596±0.018、0.463±0.019,因此,SQ1组、SQ4组、SQ1/SQ4组对HBV preS1、preS2基因m RNA的表达抑制作用较强,且SQ1/SQ4组抑制效果最显著(P<0.001)。cck8实验结果证实药物对细胞增殖无明显影响。结论:针对HBV pre1编码链3023-3037nt位点(SQ1)和pre2编码链3305~3320nt位点(SQ4)的反基因LNA具有较好的抗HBV活性,两者联合能够进一步提高抗HBV活性,且对细胞代谢、增殖基本无影响。