论文部分内容阅读
甲酸脱氢酶（Formate dedydrogenase,FDH）被认为是催化辅酶NADH高效再生的最佳酶选,绝大多数FDH是NAD-+依赖型,能专一性地把甲酸根氧化成CO2和H+,同时催化NAD+还原得到NADH。FDH构建的辅酶NADH再生体系,可与醇脱氢酶（Alcoholdedydrogenase,ADH）耦联,催化前手性酮不对称还原制备高价值的手性醇、手性氨基酸、手性羟基酸/酯等。利用重组大肠杆菌可以高效率表达FDH基因,但副产物乙酸的积累会影响细胞内FDH的积累,这一直是FDH生产一个亟待解决的问题。本工作的目的是建立拟指数流加补料高密度培养FDH重组大肠杆菌培养的发酵工艺,以副产物乙酸为关键控制点,优化工艺和补料策略,尽可能避免葡萄糖效应,减轻乙酸的抑制作用,提高FDH产量,缩短发酵周期,降低能源设备成本。并拟进一步研究FDH催化辅酶NADH体系的应用,将其与红串红球菌ADH组建耦联反应体系,催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）不对称还原生成（R）-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯（（R）-CHBE）,验证FDH催化辅酶NADH体系的应用可行性和效率。本文首先建立并验证了分阶段匀速流加补料模拟指数流加的方法,确定重组菌E.coliBL21（DE3）/pET 28a（+）-fdh的表观得率系数YX/S。在此基础上,重点研究了15 L发酵罐上FDH重组菌的拟指数流加补料高密度培养工艺。优化诱导时机、诱导前的补料策略和诱导后的比生长速率控制,以降低乙酸积累和提高FDH产量为主要调控指标。最终建立了批次发酵、诱导前流加补料和诱导后流加补料三阶段的培养模式,批次发酵结束后,采用比生长速率为0.05 h-1的拟指数流加补料策略,待生物量达到11.0 g DCW/L(OD600 25)后加入终浓度为0.4 mM的IPTG诱导,培养温度降为28℃。诱导后的比生长速率控制在0.08 h-1。pH控制在7.0。最终生物量为41.20 g DCW/L(OD600 114.8),FDH产量为26.24×103U/L,单位细胞干重FDH活力为636.9 U/g DCW。FDH的产量比批次发酵、诱导-补料（pH-stat法）两阶段法高密度培养提高了1.17倍,且大大缩短了发酵周期,节约成本。构建红串红球菌Rhodococcus erythropolis ATCC 17896的ADH重组菌E.coliBL21（DE3）/pET 28a（+）-adh,并优化了重组菌的诱导表达条件。组建ADH-FDH粗酶液耦联体系,催化COBE的不对称还原,（R）-CHBE的时空产率为7.125 mol/（L·h）,对映体过量率（e.e.）值89（±1.4）%,NADH的周转率为150 mol/mol。证明FDH催化甲酸钠再生NADH的体系是可行的,效率较高。