G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）是一大类通过G蛋白介导其生物效应的膜受体总称，也是最大的膜受体家族，其成员均参与了广泛的病理生理过程，GPCRs因介导细胞间通讯和细胞内信息传递而具有重要的生理功能和病理意义，因此GPCRs也一直是新药发现及研究的最重要靶点。迄今为止，以GPCRs为靶点的药物数量约占了市售药物的40%-50%。在总数为900个左右的GPCRs中，约有100个配基与功能均属未知的GPCR，被称为孤儿GPCRs（orphan GPCRs, oGPCRs）。由于GPCRs在病理生理以及药物研究方面的重要作用，确认oGPCRs的内源性配基及其作用机制已经成为了研究GPCRs的重要课题。对oGPCRs的特异性配基的发现和研究，被形象地称作称作“去孤儿化”。 oGPCRs的一旦成功实现了“去孤儿化”，对于相关疾病发病机制的阐明以及新药的研究发现有着重要的意义。为了能更快捷有效地对GPCRs的内源性配基及其作用机制进行探讨，我们设计了相应的研究课题。本研究主要包括两部分：第一部分是利用GPCR与G蛋白α亚基偶联的特性，将几个GPCR分子与G蛋白α亚基进行基因融合，为实现GPCR的配基筛选做准备；第二部分则是是构建了CHO-pcDNA3.1(+)-GPR91工程细胞株，为深入研究GPR91的作用机制奠定了基础。在本实验第一部分中，我们分别将GPR91，GPR119，GPR84与Gi1进行基因融合。首先通过分子克隆得到了其全长序列，之后与pMD18-T载体相连接构建重组质粒，再以重组质粒为模板，通过重叠延伸PCR技术将GPCRs与Gi1序列进行融合。将融合基因克隆到供体质粒pFASTBac1中得到重组质粒pFASTBac1-GPCRs-Gi1，而后转化大肠杆菌E.coli DH10Bac感受态，使含有融合基因的重组供体质粒实现位点的特异性转座，得到重组杆状病毒穿梭质粒pBacmid-GPCRs-Gi1。在本实验第二部分中，我们通过将GPR91全长表达序列与载体pcDNA3.1(+)相连接，再将其转入CHO细胞中，经筛选得到了阳性克隆，成功构建了CHO-pcDNA3.1(+)-GPR91工程细胞株。通过RT-PCR及Western-blot的鉴定表明，我们所构建的工程细胞株CHO-pcDNA3.1(+)-GPR91能够表达GPR91的mRNA及相应蛋白质。除此之外，我们还使用了GPR91内源性配体琥珀酸盐来刺激工程细胞株，利用荧光探针，通过激光共聚焦成像系统观察到其细胞内Ca2+浓度发生了明显改变，表明工程细胞株能够被受体激动剂所刺激，可以用于对GPR91特异性激动剂以及拮抗剂的筛选研究。