木质纤维素主要由木质素、半纤维素和纤维素三大成分组成,是地球上最丰富的可再生资源,也是生物炼制产业最可依赖的原料来源。因此关于木质纤维素的高效利用技术(如五碳糖和六碳糖共利用技术、纤维素降解技术等)一直是生物炼制领域的重点攻关方向。通过多年研究,上述技术难题正逐步得到解决。而提高微生物细胞工厂对木质纤维素糖化液中毒性生长抑制物质的耐受性是木质纤维素高效利用领域的下一个研究热点。在这些抑制物中,酚类物质(如阿魏酸、香草醛、苯酚等)是其中的主要抑制物之一。那么如何提高工业菌种对这些酚类物质的耐受性,从而尽可能的减少其对工业菌种在发酵当中的影响,就成为了急需解决的问题。谷氨酸棒状杆菌是重要的工业菌种,其在微生物发酵进行氨基酸生产当中发挥着重要的作用,特别是在工业中生产谷氨酸进而生产味精的技术已经被广泛应用。此外,其在木质纤维素糖化液中的酚类芳香族化合物的降解及耐受方面比一般的工业菌种有着较好的“天赋”。因此本研究以谷氨酸棒杆菌为研究对象,使用基于Microarray的转录组学和分子遗传学相结合的方法,揭示了其对阿魏酸、香草醛和苯酚的耐受机制。主要结果如下:1.揭示了谷氨酸棒杆菌对阿魏酸的耐受机制:(1)谷氨酸棒杆菌能够降解阿魏酸(phdA-E、pcaGH、vanAB等降解相关基因上调),从而降低了生长环境中阿魏酸的浓度,达到减轻其对细胞毒害的目的。(2)谷氨酸棒杆菌细胞被膜的复杂结构具有比其他细菌更好的保护作用,并且参与合成细胞壁及膜蛋白的基因也有着差异化的表达来适应阿魏酸胁迫。(3)谷氨酸棒状杆菌细胞生长会放缓(参与复制、转录和翻译的基因表达下调),这样可以减少阿魏酸对DNA、RNA和蛋白质的损害。(4)谷氨酸棒状杆菌细胞能激活各种防御及修复机制来应对阿魏酸的影响(如诱导SOS反应、产生Clp家族蛋白降解受损蛋白质和蛋白质修饰作用等)。通过进一步的研究发现sigE和katA突变体对阿魏酸胁迫更敏感。2.揭示了谷氨酸棒杆菌对香草醛的耐受机制:(1)谷氨酸棒杆菌能够降解香草醛(vanAB、pcaBCH等降解相关基因表达上调),从而降低了细胞周围香草醛的浓度。(2)谷氨酸棒状杆菌细胞被膜具有复杂的结构,使其具有较好的保护作用。(3)在香草醛胁迫条件下,一些与应激反应相关基因的差异化表达可以减少对谷氨酸棒杆菌细胞的损伤。(4)通过核糖体/翻译和蛋白质分泌相关基因的差异化表达来应对香草醛胁迫。还发现sigH和msrA突变体对香草醛胁迫更敏感。3.揭示了谷氨酸棒杆菌对苯酚的耐受机制:(1)谷氨酸棒杆菌可以降解苯酚(phe、pcaDF等降解相关基因表达上调),从而降低了细胞周围苯酚的浓度。(2)谷氨酸棒杆菌通过减慢细胞生长代谢速度来减少苯酚对生物大分子的损害(复制、翻译和转录相关的基因表达下调)。(3)谷氨酸棒杆菌的细胞被膜较复杂,保护作用比较强。(4)谷氨酸棒状杆菌能诱导保护和修复相关机制以适应苯酚的胁迫(诱导热休克反应、产生伴侣蛋白以帮助蛋白质折叠等)。而进一步的试验结果表明,groEL突变体对苯酚胁迫更敏感。4.通过分析谷氨酸棒杆菌对阿魏酸、香草醛及苯酚响应的Microarray数据,重点研究了在三个Microarray数据中都有着差异化表达的基因。差异化表达基因数总共有140个(73个上调,67个下调)。通过STRING数据库的分析,得到差异化表达基因所编码蛋白的相互作用网络,再经分析得到5个重要的节点蛋白(NCgl2553、NCgl1897、NCgl2586、NCgl0802、NCgl0882)。通过代谢途径分析等方法进行进一步分析,发现差异化表达基因多集中于与碳源利用相关途径和细胞膜相关途径。这表明谷氨酸棒状杆菌通过调整碳代谢机制以及细胞膜相关基因来应对有毒酚类芳香族化合物(阿魏酸、香草醛及苯酚)的影响。