【摘 要】
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干扰素是一类动物机体分泌表达的细胞因子,具有广谱抗病毒、抗肿瘤及增强机体免疫等功能。我国是世界上养鸭规模最大的国家,鸭病毒性疾病是危害养鸭业的主要疾病。当前,使用疫苗只能针对性地预防某些特定疾病的发生,对混合感染和变异毒株效果有限。因此,使用具有广谱抗病毒活性的干扰素,来防治鸭的病毒性疾病是一种理想的选择。鉴于此,本研究首次克隆并表达了鸭的β干扰素duIFN-β,并对重组duIFN-β蛋白的生物学
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干扰素是一类动物机体分泌表达的细胞因子,具有广谱抗病毒、抗肿瘤及增强机体免疫等功能。我国是世界上养鸭规模最大的国家,鸭病毒性疾病是危害养鸭业的主要疾病。当前,使用疫苗只能针对性地预防某些特定疾病的发生,对混合感染和变异毒株效果有限。因此,使用具有广谱抗病毒活性的干扰素,来防治鸭的病毒性疾病是一种理想的选择。鉴于此,本研究首次克隆并表达了鸭的β干扰素duIFN-β,并对重组duIFN-β蛋白的生物学活性和抗病毒效果进行了分析。主要研究内容如下:1.鸭Ⅰ型干扰素IFN-β的基因克隆与序列分析以提取鸭肝脏组织的总RNA为模板,RT-PCR扩增首次获得duIFN-β基因,片段大小为729bp,通过氨基酸序列分析发现与鸡IFN-β的同源性达44.44%,与哺乳动物IFN-β同源性较低,通过蛋白质三级结构预测,发现前29个氨基酸残基组成duIFN-β的信号肽区域。2.duIFN-β的原核表达和纯化在成功克隆了鸭β干扰素基因duIFN-β的基础上,我们构建了去信号肽的成熟蛋白基因(tduIFN-β)的重组质粒p ET-28a-tduIFN-β,成功建立了在大肠杆菌Rosetta(DE3)中稳定表达重组鸭β干扰素(duIFN-β)的蛋白表达纯化系统。经SDS-PAGE证实tduIFN-β与组氨酸(His)标签的融合表达,主要以可溶性上清的形式存在,重组tduIFN-β蛋白质相对分子质量约为26KDa。表达产物经过Ni2+柱纯化,通过MTT法测定蛋白对DEF细胞毒性较小,经DEF(鸭胚成纤维细胞)/VSV(水泡性口炎病毒)系统测定重组tduIFN-β蛋白的抗病毒活性为2.0x10~4U/mg。3.duIFN-β抗鸭病毒的效果分析为研究duIFN-β对鸭病毒增殖的影响,用纯化的tduIFN-β蛋白处理DEF细胞,分别接种DHAV、DTMUV、DRV,利用TCID50检测病毒滴度。与病毒对照组相比,干扰素处理DEF细胞后各病毒滴度均明显下降,说明duIFN-β能够抑制这些鸭病毒的增殖,具有广谱性。同时,体内动物试验结果证明tduIFN-β纯化蛋白能够保护雏鸭抵抗DHAV的感染。4.duIFN-β诱导ISGs的丰度分析本研究通过实时荧光定量RT-q PCR技术分析了duIFN-β对鸭干扰素刺激基因(ISG)的诱导表达效果,体外细胞试验和体内动物试验结果都显示重组tduIFN-β蛋白能够显著地上调ISGs的mRNA水平。
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