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耳聋是重大公共卫生问题,全球约有3.6亿耳聋人口。耳聋主要由遗传因素、环境因素或两者共同作用所致。m.1555A>G突变是造成氨基糖苷类抗生素诱导的非综合征聋的主要分子基础。由于缺乏合适的疾病模型,线粒体DNA突变引起的耳聋具体致病机制的研究受到一定限制。将患者体细胞诱导形成iPSCs再进一步分化形成毛细胞等,既保留有患者原有的突变,又能够从组织特异性方面更深入地阐明疾病的致病机理,是一个很好的研究线粒体疾病致病机制的疾病模型。本实验室前期建立并鉴定了患者特异性iPSCs细胞模型,本文从m.1555A>G突变对患者原代细胞和iPSCs细胞线粒体功能影响的差异方面进一步研究该突变致聋的分子致病机制。m.1555A>G突变位于线粒体12SrRNA上,为线粒体核糖体小亚基组成成分,负责线粒体蛋白质的翻译。为了检测m.1555A>G突变对细胞结构和功能方面的影响,我们分析了线粒体12SrRNA和OXPHOS复合体亚基转录和翻译水平、线粒体产ATP和ROS水平以及线粒体的超微结构。荧光定量PCR结果显示：患者原代细胞和iPSCs的12SrRNA、线粒体基因编码的OXPHOS复合体亚基ND5、CYTB、COX2、ATP8以及核基因编码的OXPHOS复合体亚基NDUFB8、SDHB、 UQCRC2、COX4和ATP 5A转录水平出现不同程度的降低；iPSCs基因转录水平大多低于原代细胞基因转录水平。Western blotting分析显示,患者原代细胞线粒体DNA编码的OXPHOS复合体亚基COX2以及ATP8翻译水平极显著降低；核基因编码的OXPHOS复合体亚基NDUFB8、SDHB、UQCRC2、COX4和ATP5A翻译水平均出现不同程度的降低(P<0.01或P<0.05); iPSCs蛋白翻译水平改变不明显,但总体低于原代细胞蛋白翻译水平。线粒体功能研究结果显示,患者原代细胞的总ATP水平以及线粒体ATP水平比正常对照组分别下降了168.8%和299.3%(P<0.05),活性氧(ROS)增加了约8.9%(P<0.05); iPSCs的ATP水平无显著差异,ROS水平增加了约13.4%(P>0.05)。透射电镜观察结果显示：原代细胞线粒体多为长棒状,iPSCs线粒体多为粒状。线粒体DNA拷贝数检测结果显示：原代细胞线粒体DNA拷贝数无显著差异,患者iPSCs线粒体DNA拷贝数升高了35.7%(P<0.01)；原代细胞线粒体DNA拷贝数显著高于iPSCs线粒体DNA拷贝数。综上所述,m.1555A>G突变导致线粒体DNA和核基因编码的OXPHOS复合体亚基转录水平下降,进一步影响OXPHOS复合体亚基的翻译水平,导致线粒体产ATP水平下降以及产ROS水平上升。线粒体功能异常引起的细胞供能不足和过多的氧化损伤可能是m.1555A>G突变导致非综合征耳聋发生的主要分子机制。本研究首次建立了m.1555A>G突变导致非综合征耳聋特异性iPSCs细胞模型,系统研究了该突变导致耳聋的致病分子机制,为耳聋的诊断和治疗提供了新的思路。