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海参鞘脂是海参体内的一类重要脂质,主要包括脑苷脂、神经酰胺及长链碱等。其中,海参脑苷脂由神经酰胺和糖基组成,神经酰胺是由长链碱与长链脂肪酸经脱水以酰胺键连接而成。研究发现,海参鞘脂具有抗肿瘤、改善阿尔茨海默症、改善糖脂代谢等功效。脂肪细胞分化及脂质代谢紊乱是导致肥胖等代谢综合征的重要因素,目前关于海参鞘脂对脂质代谢的影响已有初步报道,但其作用机制仍未阐明,且关于海参鞘脂中起作用的活性片段也没有明确的定论。本文以鞘脂含量较高的叶瓜参(Cucumaria frondosa)为实验材料,分离、制备了叶瓜参脑苷脂(Cerebroside from the sea cucumber C.frondosa, Cf-Cb)、神经酰胺(Ceramide from the sea cucumber C. frondosa, Cf-Cm)及长链碱(Long-chain base from the sea cucumber C. frondosa, Cf-LCB) 3种鞘脂,系统研究了其调控脂肪细胞分化与脂质代谢的作用及其机制,并阐明了3种叶瓜参鞘脂中起作用的活性片段。主要研究结果如下：采用传统鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,研究了3种叶瓜参鞘脂对脂肪细胞分化的影响。油红O染色结果显示,Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,且对分化早期的抑制效果最强。C/EBPα和PPARγ是脂肪细胞分化末期最重要的转录调控因子。qRT-PCR及Western blotting结果表明,Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB对C/EBPa和PPARγ的mRNA和蛋白表达均具有显著的抑制作用。WNT/β-catenin通路在脂肪细胞分化中具有重要作用,激活后显著抑制脂肪细胞分化。qRT-PCR结果表明,Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB显著地上调WNT/β-catenin通路关键基因FZ1、LRP5、LRP6、β-catenin、 CCND1和c-myc mRNA表达,但对Wnt10b及GSK3β的表达无显著性影响。Western blotting结果显示,Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB显著促进LRP6和β-catenin的蛋白表达,提高细胞核内β-catenin含量,提示3种叶瓜参鞘脂均能促进WNT/β-catenin通路的激活。21H7是β-catenin的抑制剂,可以特异性的抑制WNT/β-catenin通路的激活。结果表明,21H7干预细胞后,3T3-L1前脂肪细胞分化率,C/EBPa和PPARy的mRNA和蛋白表达均提高；而P-catenin蛋白表达,细胞核内P-catenin蛋白含量,CCND1和c-myc的mRNA表达均显著降低。Cf-Cb、 Cf-Cm和Cf-LCB均能显著改善21 H7的作用效果,进一步验证其可促进WNT/β-catenin通路的激活。综上所述,3种叶瓜参鞘脂通过激活WNT/β-catenin通路抑制3T3-L1前脂肪细胞分化。以3T3-L1成熟脂肪细胞为研究对象,研究3种叶瓜参鞘脂对脂肪细胞脂质代谢的影响。结果表明,Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均显著降低细胞中TG含量,升高培养上清中FFA含量,提示其能抑制脂质累积,促进脂质分解。脂质合成和分解的关键酶是调控脂质代谢的重要因子,是目前重要的肥胖候选研究基因。Western blotting结果显示,Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均能显著抑制脂质合成关键基因GPAT和FAS的蛋白表达,增加脂质分解关键基因HSL和CPT-1的蛋白表达。AMPK是细胞能量代谢的总开关,在调控细胞能量代谢中起到重要的作用。Western blotting结果表明,Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均显著促进AMPK及ACC蛋白的磷酸化,提示其能激活AMPK通路。Compound C是AMPK蛋白的抑制剂,可以降低AMPK的活性。结果表明,Compound C干预下,TG含量、GPAT和FAS的蛋白表达均升高；而FFA含量,HSL和CPT-1蛋白表达,AMPK和ACC的磷酸化水平均降低。Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB均显著改善Compound C的作用效果,进一步验证其能激活AMPK通路。综上所述,3种叶瓜参鞘脂通过激活AMPK通路抑制脂质合成,促进脂质分解,从而改善脂肪细胞的脂质代谢。通过建立浓度相同或长链碱含量相同的3种鞘脂两个作用体系,比较研究了Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB的作用效果,以期阐明3种叶瓜参鞘脂中起作用的活性片段。结果表明,当3种鞘脂浓度相同时,其抑制3T3-L1前脂肪细胞细胞分化,促进WNT/β-catenin通路的激活,改善脂质代谢和激活AMPK通路的作用效果以Cf-LCB为最优。而当3种鞘脂长链碱含量相同时,Cf-Cb、Cf-Cm和Cf-LCB抑制3T3-L1前脂肪细胞细胞分化,促进WNT/β-catenin通路的激活,改善脂质代谢和激活AMPK通路的作用效果相当,提示3种叶瓜参鞘脂中起作用的活性片段为长链碱。本文首次系统研究了叶瓜参鞘脂对脂肪细胞分化和脂质代谢的调控作用及其机制,并进一步阐明了其中起作用的活性片段,为海参鞘脂的进一步开发利用提供了科学基础和理论依据。