生物体内丰富的Ca²⁺除了分布于骨骼与牙齿中作为机体的基本组成外,还有少量分布于血液、细胞间液及软组织中作为第二信使,来调节大量的下游细胞信号,参与受精、收缩、细胞分化、增殖、及细胞凋亡等多个过程。细胞质与细胞核内的Ca²⁺浓度维持在50¹00 nM,高水平的Ca²⁺对细胞是有毒的,其稳态的破坏与各种代谢性疾病密切相关。因此,Ca²⁺流的适当调节是全身代谢所必需的,细胞已经进化出多种机制来维持机体Ca²⁺内稳态,使细胞内的游离Ca²⁺被严格控制在纳摩尔范围内,包括大量Ca²⁺泵和与血浆、线粒体、细胞内膜相关的通道,以及大量Ca²⁺结合蛋白（CaBPs）。CaBPs在Ca²⁺信号传导的各个方面都至关重要,从控制Ca²⁺通道的打开和关闭到调控Ca²⁺信号的强度和持续时间及将这些信号转导成生化信号或生物力学响应等各个方面都发挥着关键作用,充当了不同的角色。CaBPs的这种重要性也体现在它们与疾病的直接联系上,包括老年痴呆症、心律失常、糖尿病并发症、慢性炎症疾病和癌症。CaBPs广泛分布在细胞的各个部位,目前已有1000余种物种被鉴定。在众多CaBPs中,钙调蛋白（calmodulin）和中心蛋白（centrin）是目前最受关注的Ca²⁺-sensor,它们包含共同的结构基础:EF-hand motif。这种小尺寸蛋白的功能多样性与专一性使得它们成为一种完美的研究蛋白结构与功能关系及与Ca²⁺结合的模型。Centrin,作为一种酸性中心粒蛋白,与收缩纤维紧密相关。自从首次于单细胞绿藻（Tatraselmis striata或Chlamydomonas reinhardtii）中被发现,centrin从单细胞生物到脊椎动物,在真核生物中的分布无处不在。作为一种Ca²⁺sensor,与calmodulin类似,centrin包含两个结构域,N-端域与C-端域,中间由一段弹性的α-helix连接。晶体结构揭露了中心蛋白形状似哑铃,包含4个helix-loop-helix结构域,即所谓的EF-hand结构域。EF-hand motif于1973被正式定义,是一种最公共的Ca²⁺结合基序。Ca²⁺通常能够与EF-hand motif中的一般由12个氨基酸组成的loop区配位。Centrin与Ca²⁺结合后,会发生构象变化,由“closed”转变为“open”,疏水区暴露,由细长丝形变成类球状。此外,centrin还具有一些不同于calmodulin的性质,例如依赖其前20个氨基酸的聚集性质。该区域承担了Centrin结构与功能的多样性。研究表明,centrin在Ca²⁺存在的条件下,浓度达到10μM以上就会形成多聚体。Centrin在细胞内多个过程起到作用,广泛的研究表明centrin在细胞周期中与微管组织中心（MOTC）的复制与分离有关,然而,细胞内仅仅有10%centrin存在于微管组织中心,centrin分散存在于细胞的各个部位,涉及到光感受细胞的转导级联,信使RNA前体的形成,酵母信使RNA的输出及K⁺通道的调控。近期相关的研究发现中心蛋白还参与核苷酸切除修复的识别过程,与着色性干皮病相关蛋白（XPC）及人类同源蛋白（HR23B）形成异源三聚体,作为一种损伤探测器启动了全基因组的核苷酸切除修复（NER）。然而对于这个过程涉及到的分子机理,尤其是centrin在这个过程中的具体作用尚不清楚,仍需要进一步的研究。这有助于了解centrin的功能多样性。基于本课题组前期的研究及研究现状,本文以八肋游仆虫中心蛋白（EoCen）作为研究对象展开了以下研究。首先,应用光谱法、凝胶法及等温滴定量热法等方法研究了在10 mM pH 7.4Hepes缓冲溶液中,EoCen的N-端半分子（N-EoCen）与小牛胸腺DNA（CT-DNA）之间的非特异性相互作用,观测了二者作用后的构象变化。结果表明中心蛋白能够与DNA形成复合物,二者的作用会使得蛋白及DNA的二级结构发生变化,蛋白的疏水腔外露且α螺旋减少,DNA的双螺旋结构受到微扰。Ca²⁺结合的中心蛋白（holoN-EoCen）与DNA的作用强于没有结合Ca²⁺的中心蛋白（apoN-EoCen）与DNA的作用,这可能是由于Ca²⁺的结合使得蛋白的构象发生了变化,使其更易与DNA结合。随后,本文对N-EoCen,C-端半分子（C-EoCen）及EoCen与DNA的作用进行了比较。其次,应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）、共振光散射（RLS）、硫磺素T（ThT）荧光等研究了双链DNA（dsDNA）在金属离子存在或不存在的条件下对中心蛋白聚集性质的影响。结果发现dsDNA能够有效调控中心蛋白的自聚集或金属离子诱导的聚集,而随意卷曲的单链DNA（ssDNA）则不具有调控作用。在这个过程中,蛋白中的疏水位点可能起到作用。同时,应用琼脂糖凝胶电泳发现N-EoCen能够通过水解方式切割pBR322DNA,使得超螺旋质粒DNA首先被切成带切口型DNA,最后变成线型DNA,该过程是通过水解发生的,金属离子与蛋白的结合能够促进这种作用。丝氨酸及苏氨酸,尤其是N-端域22位的丝氨酸对于中心蛋白发挥类核酸内切酶活性具有关键作用。对于中心蛋白的这种类酶活性,目前还没有其在生物体内的生物化学角色解释,可能与NER相关,但至少这是中心蛋白中心粒外的又一新功能。最后,基于中心蛋白对于NER的体外活性的重建有重要意义,可以与XPC、HR23B形成三聚体启动全基因组核苷酸切除修复。为了了解这个过程中涉及到的分子机理,本文描述了EoCen与蜂毒素（melittin）及DNA之间的相互作用。EoCen与中心蛋白2具有66%的序列同源性。Melittin拥有能够与中心蛋白结合的关键疏水氨基酸残基（WLL）,类似于其他一些中心蛋白靶肽（Sac3、Sfi1）,该序列的氨基酸排列方向与传统中心蛋白靶肽疏水残基的排列方向相反（LLW）。因此这里melittin被作为一种天然靶肽来模拟EoCen的靶肽。结果发现melittin对EoCen的类核酸内切酶活性有抑制作用,同时,在这个过程中有三元复合物形成。另外,melittin与EoCen或DNA的结合可以调节其与另一成分的结合。这些发现提出了melittin驱动的EoCen在DNA上的重新定位,强调了多肽及中心蛋白的关键作用,可能与核苷酸切除修复识别过程中中心蛋白与靶肽的作用模型相关。