课题研究背景：脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是导致视力丧失的一种常见原因，多继发于渗出型年龄相关性黄斑变性、近视性黄斑变性、中心性浆液性脉络膜视网膜炎、眼组织胞浆菌病和眼底血管样条纹等眼病，在儿童罕见，主要与遗传性黄斑营养不良有关，尽管近年来进行了大量的基础和临床研究，但对CNV复杂分子机制的认识仍然非常有限，因此目前的治疗措施都不尽如人意。越来越多的研究证据表明，各种生长因子、抑制因子（例如VEGF因子、bFGF因子、PEDF因子等）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是新生血管形成最为重要的调控介质，ECM主要成分包括胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、玻璃体结合蛋白等结构蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG），细胞外基质中存在大量能够水解结构蛋白的蛋白酶，但降解HSPG成分的只有唯一一种乙酰肝素酶（heparanase，HPA）。目前尚无关于乙酰肝素酶在CNV研究的报道，本课题采用形态学观察、体外细胞培养、组织病理学、免疫组织化学和分子生物学研究方法，探讨了该酶在激光诱导色素鼠脉络膜新生血管形成和发展中的作用及机制。第一部分乙酰肝素酶在实验性脉络膜新生血管的表达与调控目的1．评价氪激光诱导BN大鼠CNV模型形成和发展的动态特征。2．研究乙酰肝素酶表达与氪激光诱导大鼠脉络膜新生血管生长的相关性。3．探讨HPA相关下游因子uPA和COX-2在CNV表达的意义。方法1．采用眼底氪激光光凝（激光参数：波长647nm，功率360mW，光斑直径50μm，曝光时间0.05s），诱导建立BN大鼠脉络膜新生血管动物模型，通过直接眼底观察、荧光素眼底血管造影检查和病理组织学方法进行综合评价。2．采用免疫组织化学SP法或SABC法，分别检测眼底光凝后3d、1w、2w、3w和4w时间点光凝斑CD31、HPA、uPA、COX-2蛋白表达变化，对阳性表达进行定性分析。3．采用RT-PCR方法半定量分析HPA mRNA表达水平在各时间点的动态变化。结果1．氪激光光凝后激光斑从急性水肿开始，依次经历急性炎症、水肿消退、斑痕化和色素化的增生修复过程；1w开始形成CNV，1w～4w随时间迁延CNV持续发展，以1w～2w CNV生长最为旺盛，3w、4w之间差异不明显，4w之后至12w主要表现CNV膜内纤维组织增加。2．光凝后形成CNV的血管内皮细胞来自脉络膜血管层。3．HPA mRNA和蛋白质在正常视网膜和脉络膜组织均有一定的表达，光凝后不同时间点HPA mRNA表达水平与CNV的生长呈现平行关系。4．免疫组织化学检查显示HPA、uPA、COX-2三者在CNV发展的不同时间点均有相同的表达模式，即都在CNV膜向视网膜内层进展的顶端和CNV膜内部血管组织高表达；在CNV膜内部，HPA和COX-2以血管组织表达为主，而uPA则以纤维组织表达为主。结论HPA可能通过直接降解ECM非蛋白结构，或通过上调uPA和COX-2等下游因子表达促进CNV形成和发展。第二部分乙酰肝素酶在体外血管内皮和视网膜色素上皮细胞增殖中的作用目的探讨乙酰肝素酶在体外培养血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞增殖中的作用。方法1．分别用ECM培养基和DMEM培养基体外培养原代人脐静脉内皮细胞和第5代人视网膜色素上皮细胞。2．用乙酰肝素酶抑制剂PI-88干预两种细胞的正常细胞培养过程，采用倒置显微镜下直接观察和应用四唑盐比色方法间接反映细胞增殖受到的影响。3．免疫组织化学方法检测PI-88干预后体外培养人脐静脉血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞乙酰肝素酶蛋白表达变化及无PI-88干预RPE细胞uPA和COX-2蛋白表达。结果PI-88对体外血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞的增殖均有明显的抑制作用，且二者受到抑制均呈现明显的时效和量效关系；PI-88抑制这两种细胞的增殖均与细胞乙酰肝素酶蛋白表达下调有关；uPA和COX-2蛋白在无PI-88干预RPE细胞生长过程均有表达。结论乙酰肝素酶表达与体外培养血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞的增殖过程密切相关。第三部分乙酰肝素酶抑制剂PI-88干预实验性脉络膜新生血管的在体研究目的在体研究乙酰肝素酶抑制剂PI-88对实验性脉络膜新生血管形成和发展的干预作用及相关分子机制。方法PI-88以剂量25mg·kg^-1·d^-1腹腔连续注射15d的方式干扰激光诱导大鼠CNV的生长过程；采用脉络膜巩膜铺片、眼底荧光血管造影检查和组织病理学方法综合评价PI-88干预CNV生长的效果；应用蛋白免疫杂交技术和免疫组织化学方法观察药物干扰前后HPA、uPA和COX-2的表达变化。结果光凝后3w预防组（激光当天开始应用PI-88）和治疗组（激光后1w CNV已形成时开始应用PI-88）CNV面积较对照组分别减小了52.1％和53.8％；组织病理学结果也发现，治疗组CNV膜相对厚度较对照组减小了46％；对照组和预防组在1w都开始形成CNV，但预防组荧光素渗漏较对照组明显受抑制；眼底光凝后2w，预防组已连续用药15d，治疗组用药7d，二者荧光素渗漏均较对照组明显减弱；3w，预防组已停药7d，其荧光素渗漏并未增强，而治疗组也已连续用药15d，荧光素渗漏较2w则表现明显减弱；Western blot实验发现3w时，预防组和治疗组HPA蛋白相对表达量均明显小于对照组，以预防组减少更为明显，但COX-2在预防组的相对表达量与对照组比较并未明显减少；免疫组织化学结果表明HPA、uPA的表达在治疗组受到明显抑制，而COX-2在治疗组表达并未受到明显抑制。结论PI-88不仅能够一定程度预防CNV的形成，还能使已经形成的CNV部分消退；PI-88抑制CNV的机制除直接抑制HPA表达外，还包括下游因子uPA和COX-2表达的下调，HPA调节uPA表达的作用较其调节COX-2表达的作用更为明确。