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[目的]建立一种兔脊柱角状后凸畸形(Angular kyphotic deformity,AKD)并慢性脊髓压迫(Chronic Spinal Compression,CSC)的动物模型,对建模动物进行行为学评分、影像学检查、病理组织学和分子生物学检查,探索脊柱角状后凸畸形并慢性脊髓压迫的病理及分子生物学机制。通过TUNEL法检测慢性受压脊髓的神经细胞凋亡情况、通过基因芯片检测microRNAs以及实时定量聚合酶链反应(Quantitative-Polymerize chain reaction,Q-PCR)检测受压脊髓组织中miRNA-21和miRNA-370的表达情况,探讨慢性脊髓压迫损伤(Chronic Spinal Compression injury,CSCI)中细胞凋亡的机制及细胞凋亡在CSCI中的意义,为进一步研究及临床治疗提供理论依据。[方法]健康新西兰白兔70只,4-5月龄,雌雄不拘,体重2.5-3.5 Kg。动物随机分为A、B、C、D、E五组,A组为对照组(n=14),余为实验组,其中B、C、D、E组分别为术后2周、4周、6周和8周组,每组14只动物。实验组动物采用手术方法进行建模,以L2～3椎间盘为中心包括上下椎体部分“V”形切除,切除范围包括L2～3全部椎间盘,上椎体下端和下椎体上端各2/5,“V”形顶点为L2～3椎间盘后缘,指向椎管并贴近硬脊膜,术中及术后均不做任何内、外固定;A组为假手术组,仅手术暴露L2、L3椎体前方其相应椎间盘,不行椎体及椎间盘切除。所有动物分别于术后2周、4周、6周和8周时行后肢运动功能的BBB评分,通过大体观察、腰椎X线、MRI评估腰椎角状后凸畸形致慢性脊髓压迫情况,处死动物后取脊髓标本,其中A组和实验动物6周组各取1只做microRNA基因芯片测序;2只动物脊髓标本在-20℃冰箱冷冻5min后切片,行TTC染色观察脊髓缺血情况,6只标本制作石蜡切片并通过HE染色和TUNEL法观察组织病理变化;6只行Q-PCR检测受压脊髓组织中miRNA-21和miRNA-370的表达情况[结果]1.大体观察:A组术前、术后腰椎手术节段曲度在各观察时间点均未见明显变化;实验组动物术后2周,腰椎手术节段开始出现外观可见的后凸畸形,随着观察时间延长,实验组动物AKD逐渐加重,术后6周时达高峰,术后8周时,动物的AKD进展缓慢并趋于稳定;各组动物BBB评分结果显示:A组BBB评分为(20.93±0.18)分,实验组动物随时间推移,脊髓压迫程度加重,BBB评分呈降低趋势,其中2周时为(17.51±1.80)分,4周时为(15.61±1.49)分,6周时为(13.75±1.47)分,8周时为(14.00±1.66)分,实验组(B-E组)与A组相比,差异有显著性(p<0.001);而实验组中,除D和E组间无统计学差异外(p=0.65),其余组间均存在显著差异(p<0.01)。2.X线片及MRI观察:通过观察不同组腰椎X线侧位片,测量AKD的Cobb角并记录。经统计学分析显示:A组未见明显AKD,Cobb角为(4.54±0.26)度;实验组AKD的Cobb角度随着观察时间延长逐渐增大,实验组2周组Cobb角为(30.08±3.66)度,4周组(43.77±3.51)度,6周组Cobb角最大,为(47.13±2.09)度,到8周时AKD趋于稳定,为(46.73±2.38)度。实验组(B-E组)和A组Cobb角度比较均存在显著差异(P<0.001);实验组各组间两两比较,除D和E组无统计学意义外(p=0.69),其余各组均存在显著差异(P<0.001)。通过观察不同组腰椎正中矢状位MRI,测量L2～3椎管前后径并计算椎管侵占率。A组MRI检查,椎管前后径为(4.46±0.01)mm,未发现脊髓压迫;实验组动物腰L2～3手术后2周出现L2～3节段的脊髓压迫,椎管前后径为(3.95±0.02)mm,椎管侵占率为(12.14±2.49)%,并随时间推移逐渐加重,4周时椎管前后径为(3.06±0.07)mm,椎管侵占率为(31.43± 1.44)%,到6周时脊髓压迫达到一峰值,椎管前后径为(2.37±0.81)mm,椎管侵占率为(49.12±8.90)%,实验组动物到8周时腰椎后突趋于稳定,椎管前后径为(2.50±0.21)mm,椎管侵占率为(44.13±4.59)%,脊髓压迫未见明确进展,实验组所有动物AKD以角状后凸的顶点处的脊髓压迫最为明显。L2～3椎管前后径行方差分析实验组(B-E组)与A组比较均存在显著差异(p<0.001);实验组组间两两比较均存在差异(p<0.05)。椎管侵占率行方差分析实验组与A组比较均存在显著差异(p<0.001),实验组组间两两比较均存在差(p<0.01)。3.TTC血管染色和HE染色。TTC血管染色显示:实验组与对照组比相比,脊髓受压节段及其相邻节段均有不同程度的缺血;实验组动物脊髓压迫区中后段缺血最为严重,在B、C组,脊髓压迫区呈现为小苍白区域;D、E组则出现大片苍白区域,表明存在明显的缺血坏死。HE染色显示:实验组脊髓压迫部位可见白质(White matter,WM)神经纤维减少,排列紊乱,髓鞘间隙扩大,甚至神经纤维脱髓鞘,疏网状改变,胶质细胞增生;灰质(Gray matter,GM)神经元受压变形,神经元减少,空泡形成。并随腰椎AKD和脊髓压迫程度和时间延长而加重。4.TUNEL阳性细胞检测:统计学分析结果显示:A组TUNEL阳性细胞凋亡率WM为(10.03±0.60)%,GM为(9.93±0.47)%;实验组动物随压迫时间的延长和脊髓压迫程度的加重,TUNEL阳性细胞凋亡率呈升高趋势。其中实验组 2 周时 WM 为(27.64±2.12)%,GM 为(24.86±0.87)%;4 周时 WM 为(42.81±1.89)%,GM 为(30.05±1.19)%;6 周时 WM 为(49.12±2.89)%,GM 为(44.14±2.57)%;8 周时 WM 为(49.07±2.88)%,GM 为(43.64±2.95)%。术后 2周时凋亡细胞较A组增加,6周达到高峰,而8周时较6周减少。WM中TUNEL阳性细胞凋亡率实验组(B-E组)与对照组(A组)比较均存在显著差异(p<0.001);组间两两比较:除D组和E组无统计学意义外(P=0.97),余均存在显著差异(p<0.001)。GM实验组与A组比较均存在显著差异,p<0.001;实验组组间两两比较:除D组和E组无统计学意义外(P=0.65),其余各组均存在显著差异(p<0.001)。各组WM与GM行两两比较的t检验,发现各组WM与GM存在差异(P<0.05),各组WM比GM细胞凋亡率高。5.microRNAs基因测序和Q-PCR检测。兔脊髓microRNAs基因测序共发现1254种microRNAs,与对照组相比,实验组动物脊髓中有511种变化的microRNAs,其中有65种microRNAs发生显著变化。Q-PCR检测miR-21和miR-370 Ct值,统计结果显示:A组miR-21Ct值为17.44±0.31,miR-370 Ct 值为 25.75±0.14;实验组 2 周时 miR-21Ct 值为 21.28±2.63,miR-370 Ct 值为 22.22±1.54;4 周时 miR-21Ct 值为 24.34±0.71,miR-370 Ct 值为 21.60±2.86;6 周时 miR-21Ct 值为 26.99±0.66,miR-370 Ct 值为 17.76±0.28;8 周时 miR-21Ct 值为 26.73±0.21,miR-370Ct 值为 18.50±0.35。实验组(B-E组)与对照组(A组)比较,miR-21和miR-370 Ct值均存在显著差异(p<0.001)。miR-21 Ct值组间两两比较除D组和E组无统计学意义外(P=0.73),其余各组存在差异(p<0.05);miR-370 Ct值组间两两比较,B组与C组比较无统计学意义(P=0.48),D组与E组比较无统计学意义(P=0.40),其余各组均存在显著差异,P≤0.001。由于microRNACt值与microRNA在脊髓中的表达量相反,所以实验组动物随脊髓压迫时间的延长和压迫程度的加重,脊髓中miR-21前6周逐渐减少;而脊髓中miR-370前6周逐渐增多,但实验组术后2周到4周组miR-370增多并不明确。8周时MiR-21和miR-370与6周时相比未见明显变化。[结论]1.本研究成功地建立了一种兔腰椎AKD并发CSC的动物模型。该模型建模方法简单、可重复性好,为进一步研究AKD以及所致的CSCI的病生机制和分子生物学改变等提供了一种实用的、较好模拟临床疾病的动物模型。2.CSC导致压迫区及邻近脊髓区域的明显缺血改变,在该过程中,细胞凋亡在CSC导致的神经细胞的消亡中起重要作用,并与压迫的程度及时间明显相关。3.首次报道了CSCI中,miR—21和miR-370介导的神经信号途径在神经细胞的凋亡中起到重要作用。