目的:血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的主要发病机制,通过发生炎症反应、氧化应激等过程对动脉粥样硬化的形成和发展起着重要作用,但是其具体的分子机制还不是很清楚。内皮细胞损伤后的病理机制是比较复杂的级联反应,而细胞内钙离子浓度的变化是内皮细胞损伤的关键病理过程之一,当细胞内钙离子过多积聚时会引发一系列的级联反应,最终导致细胞损伤。与细胞内钙离子的调控密切相关的细胞器是线粒体,线粒体钙离子单向转运体（Mitochondrial calcium uniporter,MCU）是新近鉴定出来的,存在于线粒体内膜上并参与线粒体钙摄取的重要结构。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Proline-rich tyrosine kinase 2,Pyk2）是粘着斑激酶家族中的一员,它与细胞内钙离子浓度的变化和MCU的调节都存在一定的关系。但是其相互之间的作用机制及在动脉粥样硬化中的作用仍不清楚,因此对于这种高度复杂且精确的调节仍有待进行深入的研究探讨。本研究,我们以人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）为研究对象,通过过氧化氢（H₂O₂）诱导内皮细胞损伤,研究Pyk2/MCU通路是否参与了动脉粥样硬化引起的内皮细胞损伤过程,从而促进AS的形成和发展。方法:1. 建立H₂O₂诱导的HUVECs氧化应激模型。实验分为对照组、过氧化氢组（750μM,24h）,瑞舒伐他汀（Rosuvastatin,Rosu,2.5μM,5μM和10μM）+过氧化氢（750μM,24h）组。对细胞活性的检测我们利用MTS染色法,检测H₂O₂诱导的HUVECs损伤后细胞活力的变化以及瑞舒伐他汀对内皮细胞的作用,并通过实时定量荧光聚合酶链式反应（Real-time reverse transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）和western blot分别检测Pyk2、MCU mRNA和蛋白质的表达。2.按上述分组,用流式细胞学检测方法检测线粒体膜电位、ROS（reactive oxygen species）、细胞内钙离子和凋亡的改变。收集HUVECs,将样本进行包埋、切片,用透射电镜观察不同分组的细胞形态和超微结构的变化。采用酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法定量测定血管紧张素-2（Ang II）的浓度。3.应用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）技术使Pyk2基因低表达来观察相关指标的变化情况。实验分组为blank（空白对照）组、blank+H₂O₂组、NC（Non-specific Control）+H₂O₂组、shRNA+H₂O₂组、Rosu+H₂O₂组、shRNA+H₂O₂+Rosu组。同样,MTS染色法检测细胞活力,细胞内Ca²⁺浓度和线粒体膜电位的改变情况利用流式细胞学技术来检测,通过western blot技术检测了Pyk2、MCU、caspase-3在蛋白水平的表达情况。结果:1. 随着H₂O₂浓度的增加,细胞活力明显下降,与对照组相比,给予750μM H₂O₂干预时细胞活力下降约50%（P<0.05）。不同浓度的瑞舒伐他汀（2.5μM,5μM,10μM）预处理HUVECs,培养24h,在瑞舒伐他汀浓度为2.5、5μM时,HUVECs存活率明显增加,对内皮细胞起到了一定的保护作用（P<0.05）。2. Realtime-qPCR结果显示,H₂O₂模型组Pyk2/MCU mRNA的表达明显高于对照组（P<0.05）,瑞舒伐他汀2.5μM和5μM组较模型组表达下降（P<0.05）,其中5μM瑞舒伐他汀组下降最明显（P<0.05）。H₂O₂诱导的HUVECs损伤模型中,Pyk2和MCU的蛋白表达水平分别升高（P<0.05）,而瑞舒伐他汀对逆转这些变化具有显著的作用（P<0.05）。3. 流式细胞学检测结果显示,H₂O₂可明显诱导细胞内钙离子升高、线粒体膜电位降低、活性氧增加和细胞凋亡（P<0.05）;在H₂O₂诱导的HUVECs损伤模型中,通过透射电镜观察我们还发现内质网扩张程度及线粒体损伤程度在不同的干预组中变化不同,表现为对照组内皮细胞形态正常,细胞核及核膜完整,核仁清晰,胞质内的细胞器如内质网与线粒体完整可见。而H₂O₂组内皮细胞中的线粒体肿胀,线粒体嵴消失,线粒体空泡化严重,内质网溶解,核膜溶解,胞核固缩。与H₂O₂组相比,经瑞舒伐他汀预处理的细胞损伤减轻,核仁较模型组清晰,细胞膜、线粒体、内质网等破坏程度减轻;通过ELISA分析我们得到结果,Ang II的浓度在不同处理组中也有不同的变化。4. 采用shRNA技术使HUVECs中的Pyk2低表达,然后对细胞给予不同的处理,观察比较Pyk2基因低表达时,抗内皮损伤作用如何变化。结果显示:与blank+H₂O₂组相比,shRNA+H₂O₂组的细胞活力明显增加（P<0.05）,同样,Rosu+H₂O₂组也对细胞起了保护作用（P<0.05）。NC+H₂O₂组的细胞增殖情况与blank+H₂O₂组相比无明显变化。NC+H₂O₂组与shRNA+H₂O₂组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。此外,shRNA+H₂O₂+Rosu组比单独使用瑞舒伐他汀具有更强的保护作用（P<0.05）;在线粒体膜电位和细胞内游离Ca²⁺浓度的变化结果中,我们观察到shRNA+H₂O₂组的细胞内自由Ca²⁺浓度呈下降趋势,但与H₂O₂组比较未达到显著统计学意义（P>0.05）。然而,给予瑞舒伐他汀治疗后,细胞内Ca²⁺显著下降（P<0.05）,且在shRNA+H₂O₂+Rosu组下降更为明显（P<0.05）。进一步证实抑制Pyk2/MCU通路对内皮细胞有保护作用。在线粒体膜电位的检测中,我们发现shRNA+H₂O₂组较blank+H₂O₂组膜电位升高,且在使用瑞舒伐他汀干预后,这一趋势更为明显,但差异未达到显著统计学意义（P>0.05）;对Pyk2,MCU和caspase-3在蛋白水平进行检测,结果显示,与blank+H₂O₂组相比,H₂O₂+Rosu组的上述三种蛋白表达降低（P<0.05）,与NC+H₂O₂组相比,shRNA+H₂O₂组,shRNA+H₂O₂+Rosu组的上述三种蛋白表达降低（P<0.05）,与此同时,shRNA和瑞舒伐他汀同时作用对Pyk2、MCU和caspase-3有较强的抑制作用（P<0.05）。结论:1.Pyk2/MCU通路参与了H₂O₂引起的内皮细胞损伤反应。2.瑞舒伐他汀通过抑制Pyk2/MCU通路对H₂O₂诱导的损伤发挥保护作用,提示Pyk2/MCU通路可能成为动脉粥样硬化干预的新靶点。