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目的:生物钟基因在生物体生理过程（如体温变化,血压波动以及脂质、糖类及胆固醇代谢等）的昼夜变化中发挥重要的调控作用。Flavin-containing monooxygenases（FMOs）是一类参与许多药物（例如苄达明、甲巯咪唑和阿苯达唑等）和环境有毒物质（例如杀虫剂和涕灭威等）代谢的I相酶系。据报道,许多I相药物代谢酶（drug-metabolizing enzymes;DME）如CYP1A2、CYP2A4/5、CYP2B10和CYP3A11等的表达呈现昼夜节律。然而,FMO（非CYP类I相酶）的昼夜节律仍未被探索。本研究旨在考察小鼠肝脏FMO5表达和活性的昼夜节律性,并探讨生物钟基因（Bmal1、Rev-erbα和E4bp4/Dbp）在其昼夜节律产生中的潜在作用。方法:1.以野生型小鼠为研究对象,收集小鼠肝脏。采用实时荧光定量核酸扩增检测（qPCR）和蛋白质免疫印迹技术（Western blotting）,检测小鼠肝脏中FMO5在六个昼夜时点（ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22）的表达。此外,采用高浓度血清刺激法,检测Fmo5在细胞水平的周期性表达。并采用体外肝微粒体孵育实验,进行不同时间点小鼠肝脏FMO5活性评价。2.用野生型小鼠进行己酮可可碱（PTX）的时辰药代动力学研究。分别于不同昼夜时点（ZT2和ZT14）腹腔注射给予小鼠PTX（50 mg/kg）,并于设定时间点收集血浆和肝脏样品,采用UPLC-QTOF/MS法测定血浆及肝脏中药物浓度。基于非房室模型,评价PTX及其代谢物PTX-M的体内药代动力学参数及组织分布的时辰差异。3.以Bmal1-/-、Rev-erbα-/-和E4bp4-/-以及野生型同窝对照(Bmal1+/+、Rev-erbα+/+和E4bp4+/+)小鼠为研究对象,采用qPCR和Western blotting检测小鼠肝脏中FMO5在六个昼夜时点的表达,评价生物钟基因Bmal1、Rev-erbα和E4bp4对FMO5节律表达的影响。4.采用细胞转染技术,高表达或敲低小鼠原代肝细胞和/或肝癌细胞中Bmal1、Rev-erbα和E4bp4的表达,在体外考察生物钟基因Bmal1、Rev-erbα和E4bp4对FMO5节律表达的影响。5.采用荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀实验（Ch IP）解析生物钟基因对Fmo5的分子调控机制。结果:1.FMO5表达和活性具有昼夜节律。代谢酶FMO5在野生型小鼠肝脏中的mRNA和蛋白表达具有昼夜节律,在ZT14左右达到峰值。在体外肝微粒体孵育实验中,我们选用FMO5的活性底物PTX作为模型药物。结果显示,FMO5活性的昼夜波动与酶的节律性表达一致。在血清刺激的Hepa1-6细胞中,Fmo5 mRNA也呈现节律性表达。表明,Fmo5是昼夜节律基因。2.体内FMO5活性具有时辰依赖性。PTX代谢（PTX-M形成）具有明显的给药时间依赖性。ZT14给药时血浆和肝脏的PTX-M浓度均明显高于ZT2给药时的浓度。3.Bmal1、Rev-erbα和E4bp4敲除导致FMO5节律表达发生紊乱。本研究采用Bmal1-/-、Rev-erbα-/-和E4bp4-/-小鼠研究三种顺式作用元件在FMO5节律性表达中的作用。Bmal1、Rev-erbα和E4bp4敲除导致FMO5节律表达发生紊乱。在Bmal1-/-和Rev-erbα-/-小鼠中,FMO5表达下调,而在E4bp4-/-小鼠中,FMO5表达上调。4.Bmal1正向调控细胞中FMO5的表达。在小鼠原代肝细胞和Hepa1-6细胞中,Bmal1过表达导致FMO5 mRNA和蛋白水平显著升高。Bmal1敲低（利用si RNA敲低）使FMO5 mRNA和蛋白的表达降低。5.E4bp4和Rev-erbα调控原代小鼠肝细胞中FMO5的表达。E4bp4过表达导致FMO5 mRNA和蛋白水平显著降低,而E4bp4敲低导致FMO5的表达增加。表明,E4bp4是Fmo5的负调控因子。Rev-erbα对FMO5的表达具有正向调控作用。然而,Rev-erbα是转录抑制因子,提示,Rev-erbα不能直接调控FMO5的表达。Rev-erbα对Fmo5的正向调控过程需要负调控因子的参与。有趣地是,Rev-erbα对Fmo5的调控作用在沉默E4bp4的细胞中减弱。6.时钟基因转录调控Fmo5的表达。Bmal1通过直接结合基因启动子中E-box元件（-1822/-1816 bp）来激活Fmo5表达。E4bp4（转录抑制因子）直接结合于基因启动子中的D-box1和D-box3元件,抑制Fmo5的表达。Dbp直接结合于基因启动子中的D-box1元件,激活Fmo5的表达。结论:本研究在mRNA、蛋白和酶活水平上揭示肝脏Fmo5的昼夜节律属性。Fmo5节律性表达是通过E-box和D-box顺式元件结合蛋白（包括BMAL1、E4BP4和DBP）而产生的。本研究对于深入理解生物钟调控药物代谢的分子机制和时辰治疗学的实践具有重要意义。