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背景与目的外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)是一种不同于脑挫伤所致的蛛网膜下腔出血和病理性蛛网膜下腔出血的独立蛛网膜下腔出血,与外伤性硬脑膜外出血、硬脑膜下腔出血并列为三大外伤性颅内腔隙出血。国内外学者报道的TSAH常与酗酒有关,但其发生及死亡机制的研究性报道较少见。因此,探讨和阐释急慢性酒精中毒相关的TSAH发生及死亡机制,可为其死因分析、司法审判量刑提供科学的理论依据。本课题组前期工作已成功地建立了大鼠急慢性酒精中毒TSAH模型,结果显示,脑震荡性轻微外力打击灌酒后大鼠的TSAH发生率:慢性组82.4﹪、急性组28.6%,死亡率:慢性组58.8﹪、急性组0﹪,慢性灌酒组TSAH发生率及死亡率远大于急性灌酒组。并从MMP-9血管壁毒性物质、血管壁形态结构及其生物力学,Ngb、Hif-1α、EPO、Na~+,K~+-ATPase等脑氧和能量代谢物,tPA、Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Bax等细胞凋亡相关物质,证实了酒精的综合性毒理学作用在TSAH发生及死亡机制中具有重要作用。本实验是在此基础上,进一步探讨慢性灌酒大鼠TSAH高死亡率与胶质细胞改变的关系,选择与中枢神经纤维功能结构密切相关的胶质细胞特异性标志物S-100β、MBP,探讨急慢性酒精中毒情况下脑组织S-100β、MBP的表达,及其与大鼠TSAH死亡机制的相关性。材料与方法1动物模型及分组SPF级成年雄性SD大鼠61只,体重300±50g,分笼适应性饲养2周,随机分组。1.1急性灌酒模型28只大鼠随机分急性单纯灌酒组、急性灌酒打击组、急性单纯灌水组、灌水打击组共4组,每组7只。灌酒组一次性白酒(北京红星酒厂二锅头,52%v/v)灌胃15ml/kg;灌水组同等剂量的食用水灌胃。打击组在灌白酒或食用水后2h,给予脑震荡性打击。1.2慢性灌酒模型33只大鼠随机分为慢性单纯灌酒组7只、慢性灌酒停酒打击组7只、慢性灌酒打击组19只(其中死亡10只归为死亡组,存活9只归为存活组)共4组。各组大鼠给予白酒灌胃(北京红星酒厂二锅头,52%v/v),一天两次,间隔8小时,前2周每次予灌胃剂量8ml/kg、后2周每次灌胃剂量予12ml/kg,最后一次灌酒后2h,慢性灌酒停酒打击组于灌酒后12h,给予脑震荡性打击。2方法各灌酒打击和灌水打击组大鼠予脑震荡打击后,放置4h予乙醚麻醉,开胸左心室取血5ml,死亡的大鼠立即开胸取血5ml,经左心室-主动脉插管,灌注4%中性多聚甲醛液处死兼固定脑组织,开颅取全脑,置于4%中性多聚甲醛固定、取材,常规石蜡包埋、HE切片染色,固绿(Fast green)髓鞘染色观察脑组织及髓鞘组织形态学,S-100β、MBP免疫组化染色,Image-Pro Plus 6.0图像分析软件体视学量化组织病理学观测,BAC检测。所有数据均应用SPSS15.0统计软件,t检验和单因素方差、卡方检验统计分析。结果1急慢性酒精中毒大鼠行为学表现和BAC变化急性灌酒组大鼠灌酒后0.5h内活动增多、不停张望,呈兴奋状态,之后活动减少、步态不稳、动作笨拙,呈昏睡、呼吸缓慢,反应迟钝等醉酒表现。灌酒后2h血酒精浓度(BAC)180.16±16.58 mg/dL、血压14.13±0.34 Kpa,较灌酒前血压17.02±0.88 Kpa显著下降(P<0.01);灌水组灌胃后行为及血压均无明显变化(P>0.05)。慢性灌酒组大鼠灌酒期间,逐渐出现消瘦、营养不良、进食减少,精神萎靡、部分一侧肢体偏瘫等慢性酒精中毒改变,4w后体重251.8±19.6g较灌胃前307.2±28.9g明显下降(P<0.01)、血压18.16±0.82Kpa较灌胃前16.60±0.76Kpa明显增高(P<0.01)。灌酒后0.5h内呈侧卧、昏睡、翻正反射消失等急性酒精中毒表现,最后一次灌酒2h后BAC 208.50±32.35 mg/dL高于急性组。2 TSAH发生率、死亡率及病理学观察急性灌酒打击组大鼠TSAH发生率为28.6%,无死亡,灌水打击组未见TSAH发生及死亡;慢性灌酒打击组的TSAH发生率为84.2%、死亡率52.6%,慢性灌酒停酒打击组的TSAH发生率为71.4%、死亡率28.6%,死亡率较慢性灌酒打击组有显著差异(P<0.01)。急性单纯灌水组大脑表面散在局限性淤血;急性灌水打击组大鼠脑表面光滑,呈蜡样苍白;急性单纯灌酒组大鼠额叶及小脑表面大片淤血;急性灌酒打击组发生TSAH的大鼠脑表面及脑干背侧、腹侧斑片状薄层SAH;慢性灌酒打击组发生TSAH的大鼠全脑弥漫厚层SAH,以脑干腹侧面为重。组织学检查,急性灌酒组脑神经元及神经胶质细胞轻度水变性、细胞周隙轻度扩大,打击组脑干及小脑薄层SAH。慢性灌酒组脑皮质各层神经元排列紊乱、数目减少、核固缩,多见噬神经现象;小脑蒲肯野细胞疏松较少、胞体三角形固缩变小、突起减少、核固缩深染,部分溶解消失;延脑多见均质化胞浆深染固缩、核固缩的暗神经元(Dark cell);打击组脑干、额顶、小脑等处大片厚层SAH。固绿髓鞘染色(髓鞘呈深绿色、细胞核呈红色),急性单纯灌水组脑干、胼胝体及小脑神经纤维髓鞘平直、排列紧密;急性灌酒打击组的髓鞘排列稍疏松、间隙大,着色稍淡;慢性打击组的髓鞘疏松、间隙增大,着色浅淡不均,脑干可见明显不规则增粗扭曲、断裂神经纤维,周隙明显扩大。3 S-100β蛋白、MBP的表达3.1 S-100β蛋白阳性细胞数急性灌酒打击组和灌水打击组大鼠各脑区S-100β阳性细胞数均显著多于急性灌酒和急性单纯灌水组(P<0.05);打击组之间、单纯组之间均无统计学差异(P>0.05)。慢性灌酒打击存活组和慢性灌酒停酒打击存活组大鼠各脑区阳性细胞数均显著多于慢性单纯灌酒组和慢性灌酒打击死亡组(P<0.05);慢性灌酒打击存活组和慢性灌酒停酒打击存活组之间、慢性单纯灌酒组和慢性灌酒打击死亡组之间均无显著差异(P>0.05)。慢性灌酒打击存活组和慢性灌酒停酒打击存活组大鼠各脑区阳性细胞数均显著多于各急性组(P<0.05);慢性单纯灌酒组和慢性灌酒打击死亡组各脑区阳性细胞数均多于各急性单纯灌酒和急性单纯灌水组(P<0.05),与急性灌酒打击组和灌水打击组无显著差异(P>0.05)。3.2 S-100β蛋白IOD值急性灌酒打击组和灌水打击组各脑区S-100βIOD值均高于急性单纯灌酒组和急性单纯灌水组(P<0.05),打击组之间、单纯组之间无统计学差异(P>0.05)。慢性单纯灌酒组的IOD值最高,均显著高于其它慢性灌酒组(P<0.05);慢性灌酒打击死亡组的IOD值最低,均显著低于其它慢性灌酒组(P<0.05);慢性灌酒打击存活组与慢性灌酒停酒打击存活组的IOD值无显著差异(P>0.05)。除慢性灌酒打击死亡组以外,其它慢性灌酒组的IOD值均高于急性组;慢性灌酒打击死亡组的IOD值与急性灌酒打击和灌水打击组无显著差异(P>0.05),高于急性灌酒和急性单纯灌水组(P<0.05)。3.3 MBPIOD值急性灌酒打击组和急性灌水打击组脑干和胼胝体MBP IOD值均显著低于单纯灌酒和单纯灌水组(P<0.05),打击组之间、单纯组之间无统计学差异(P>0.05);小脑各组间均无显著差异(P>0.05)。慢性单纯灌酒组各脑区MBP IOD值最高,高于其它各慢性灌酒打击组(P<0.05);各慢性灌酒打击组之间胼胝体及小脑MBP IOD值无显著差异(P>0.05);慢性灌酒打击死亡组脑干MBP IOD值高于慢性灌酒打击存活组及慢性灌酒停酒打击存活组(P<0.05),存活组之间无显著差异(P>0.05)。除慢性单纯灌酒组与急性打击组大鼠各脑区MBP IOD值无显著差异外(P>0.05),慢性灌酒组各脑区MBPIOD值均低于急性组(P<0.05)。结论1、急慢性酗酒均可协同脑震荡性打击促发TSAH,慢性酗酒是TSAH死亡重要因素。2、慢性酒精中毒脑组织胶质细胞S-100β蛋白表达增强、神经纤维髓鞘MBP表达减弱,可能参与慢性酗酒的酒精性脑萎缩和酒精性脑病发生机制,并且构成慢性酗酒的TSAH死亡机制的物质基础。